技术摘要：
本发明涉及含有荧光蛋白片段的融合蛋白及其用途。具体地，本发明提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白具有(P1‑L1)s‑A1‑(X)n‑A2‑(L2‑P2)t所示的结构。所述融合蛋白中的(X)n或A1‑(X)n，可促进融合目的肽的折叠和表达，并且可提高融合蛋白的溶解性并降低融合蛋白的分 全部
背景技术：
肽是一类生物分子，其被广泛地在许多生物医学研究领域中用作试剂、在疾病的 治疗中用作治疗性药物、在检测病原菌中用作诊断剂以及用作生物标记物。合成肽通常有 两种方法，一种是化学合成，另外一种是重组表达。化学合成已被用于制备多种治疗性肽， 包括可的瑞林、甲状旁腺素(PTH)、胰高血糖素样肽(GLP-1)及其衍生物艾塞那肽和利拉鲁 肽、恩夫韦肽、降血钙素、比伐卢定、齐考诺肽、舍莫瑞林、生长瑞林、分泌素、替度鲁肽和胰 岛素。该方法需要氨基酸片段的多步缩合而形成肽，同时也需要繁琐的保护、去保护和纯化 等步骤。到目前为止，大多数低于50个氨基酸残基的商业化肽是用这种方法生产。由于制药 行业和生物医学研究中肽的需求在不断增加，用于化学合成的氨基酸片段的价格也在持续 攀升。因此，日常使用的治疗性肽药物比如GLP-1类似物，在未来将难以保持可以承受的价 格。尽管化学合成小于50个氨基酸残基的肽在技术上是可行的，但较低的产量以及合成过 程中产生的大量的有机废物是相当不合算的。现在，大多数超过50个氨基酸残基的肽是在 细菌、酵母、昆虫、哺乳动物等细胞宿主中重组表达的。多年来，使用融合蛋白表达多肽一直 是比较常用的方法。但是，用于肽表达的现在可用的融合蛋白方法存在许多技术上的问题， 尤其是对于产生小于50个氨基酸残基的肽。例如现有技术中的融合蛋白分子量大，疏水性 强，很难分离，目标蛋白的比重低，融合比低，结构稳定，难以酶切，上样离子柱、疏水柱死体 积很多。 因此，非常有必要研发一种新的用于表达目的肽的融合蛋白，克服现有融合蛋白 的限制，同时能够提高插入非天然氨基酸蛋白的产生，如提高带有BOC-赖氨酸蛋白等非天 然氨基酸蛋白的产量。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种新的用于表达目的肽的融合蛋白，同时能够提高插入非 天然氨基酸蛋白的产生，如提高带有BOC-赖氨酸蛋白等非天然氨基酸蛋白的产量。 本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括式I所示的结构： (P1-L1)s-A1-(X)n-A2-(L2-P2)t (I) 式中， “-”为肽键或连接肽， 各个P1各自独立地为第一目的肽； 各个P2各自独立地为第二目的肽； 各个L1各自独立地为无或第一连接肽； 各个L2各自独立地为无或第二连接肽； A1为无或信号肽； 3 CN 111718417 A 说 明 书 2/15 页 A2为无或信号肽； 各X独立地为荧光蛋白的单个β-折叠单元； n为1-8的正整数； s为0、1、或2； t为0、1、或2；以及 附加条件是s和t不同时为0。 在另一优选例中，s为0，而t为1。 在另一优选例中，s为1，而t为0。 在另一优选例中，所述n为1-6，较佳地，n为2-4。 在另一优选例中，所述A1为信号肽，A2为无。 在另一优选例中，所述的β-折叠单元选自下组：荧光蛋白的β-折叠单元u1、u2、u3、 u4、u5、u6、u7、u8、u9、u10和u11。 在另一优选例中，所述的各X的长度为10-14aa。 在另一优选例中，各X是不同的。 在另一优选例中，各X是相同的。 在另一优选例中，所述的荧光蛋白选自下组：绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白 (YFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、青色荧光蛋白基因(CFP)、或其组合。 在另一优选例中，所述的荧光蛋白为绿色荧光蛋白(GFP)。 在另一优选例中，所述GFP具有如SEQ ID NO.:13所示的氨基酸序列。 在另一优选例中，所述的任意两个β-折叠单元之间具有或不具有柔性接头I。 在另一优选例中，所述的(X)n作为蛋白表达促进元件。 在另一优选例中，所述的(X)n的总长度Ln为荧光蛋白总长度L0的15-70％，较佳地 20-60％，更佳地25-50％。 在另一优选例中，所述的X选自下组： uj，其具有SEQ ID NO.:j所示的氨基酸序列； 其中，j为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或11。 在另一优选例中，所述的X选自下组： X 氨基酸序列 u1 VPILVELDGDVNG(SEQ ID NO.:1) u2 HKFSVRGEGEGDAT(SEQ ID NO.:2) u3 KLTLKFICTT(SEQ ID NO.:3) u4 YVQERTISFKD(SEQ ID NO.:4) u5 TYKTRAEVKFEGD(SEQ ID NO.:5) u6 TLVNRIELKGIDF(SEQ ID NO.:6) u7 HNVYITADKQ(SEQ ID NO.:7) u8 GIKANFKIRHNVED(SEQ ID NO.:8) u9 VQLADHYQQNTPIG(SEQ ID NO.:9) u10 HYLSTQSVLSKD(SEQ ID NO.:10) 4 CN 111718417 A 说 明 书 3/15 页 u11 HMVLLEFVTAAGI(SEQ ID NO.:11) 在另一优选例中，所述X还包括如SEQ ID NO.:1-11中任一所示序列中的R、K、H相 互替换产生的氨基酸序列；和/或 所述X还包括如SEQ ID NO.:1-11中任一所示的序列中的P、Q相互替换形成的氨基 酸序列；和/或 所述X还包括如SEQ ID NO.:1-11中任一所示的序列中的T、S相互替换形成的氨基 酸序列。 在另一优选例中，所述X选自下组： (A)具有SEQ ID NO:1-11任一所示氨基酸序列的多肽； (B)具有与SEQ ID NO:1-11任一所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地≥85％，更 优选地≥90％，更优选地≥95％，最优选地≥97％的同源性)且保留所述特性的多肽； (C)将SEQ ID NO:1-11任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或 添加而形成的，且保留所述特性的衍生多肽。 在另一优选例中，所述(X)n为u8、u9、u2-u3、u4-u5、u8-u9、u1-u2-u3、u2-u3-u4、 u3-u4-u5、u5-u6-u7、u8-u9-u10、u9-u10-u11、u3-u5-u7、u3-u4-u6、u4-u7-u10、u6-u8-u10、 u1-u2-u3-u4、u2-u3-u4-u5、u3-u4-u3-u4、u3-u5-u7-u9、u5-u6-u7-u8、u1-u3-u7-u9、u2- u2-u7-u8、u7-u2-u5-u11、u3-u4-u7-u10、u1-I-u2、u1-I-u5、u2-I-u4、u3-I-u8、u5-I-u6、或 u10-I-u11。 在另一优选例中，所述A1或A2具有如SEQ ID NO.:12(MVSKGEELFTGV)所示的氨基 酸序列。 在另一优选例中，所述A1-(X)n具有如SEQ ID NO .:14、15、16、17、22、23、24、26、 27、28、29或30所示的氨基酸序列。 在另一优选例中，第一连接肽含有第一酶切位点(如TEV酶切位点)。 在另一优选例中，第二连接肽含有第二酶切位点。 在另一优选例中，所述的柔性接头I中含有第三酶切位点。 在另一优选例中，所述第三酶切位点为肠激酶(较佳地为EK酶)酶切位点，较佳地 为DDDDK(SEQ ID NO.:25)。 在另一优选例中，所述(X)n为u1-EK-u2、u1-EK-u5、u2-EK-u4、u3-EK-u8、u5-EK- u6、或u10-EK-u11,其中EK为EK酶酶切位点。 在另一优选例中，所述的第一、第二和第三酶切位点是各不相同的。 在另一优选例中，所述的第一、第二和第三酶切位点中有两个或三个是相同的。 在另一优选例中，在P1和P2中均不存在所述的第一、第二和第三酶切位点。 在另一优选例中，所述第一连接肽和/或第二连接肽还含有不同于第一、第二和第 三酶切位点的酶切位点。 在另一优选例中，所述第一连接肽和/或第二连接肽含有胰蛋白酶酶切位点，较佳 地，所述第一连接肽和/或第二连接肽含有至少一个精氨酸(R)或赖氨酸(K)。 在另一优选例中，所述第一连接肽的C末端的氨基酸为Arg或Lys。 在另一优选例中，所述第二连接肽的N末端的氨基酸为Arg或Lys。 在另一优选例中，所述第一连接肽和/或第二连接肽还含有烟草蚀纹病毒蛋白酶 5 CN 111718417 A 说 明 书 4/15 页 识别序列。 在另一优选例中，所述第一连接肽和/或第二连接肽具有如SEQ ID NO.:18所示的 氨基酸序列。 在另一优选例中，所述第一连接肽和/或第二连接肽还含有协助表达和/或纯化的 标签序列。 在另一优选例中，所述标签序列为组氨酸标签，较佳地为6×HIS标签。 在另一优选例中，所述的P1和P2各自独立地选自：人胰岛素前体蛋白、赖脯胰岛素 的前体蛋白、甘精胰岛素的前体蛋白、甲状旁腺素、可的瑞琳、降血钙素、比伐卢定、胰高血 糖素样肽及其衍生物艾塞那肽和利拉鲁肽、齐考诺肽、舍莫瑞林、生长瑞林、分泌素、替度鲁 肽、水蛭素、生长激素、生长因子、生长激素释放因子、促肾上腺皮质激素、释放因子、德舍瑞 林、去氨加压素、依降钙素、胰高血糖素、亮丙瑞林、促黄体激素释放激素、生长激素抑制素、 促甲状腺激素释放激素、曲普瑞林、血管活性肠肽、干扰素、甲状旁腺激素、BH3肽、淀粉样变 肽、或上述各肽的片段、或其组合，优选于但不限于上述多肽。 在另一优选例中，所述的P1和P2各自独立地为带有非天然氨基酸的蛋白。 在另一优选例中，所述的P1和P2各自独立地具有长度10-200个氨基酸的序列，较 佳地，具有长度10-80个氨基酸的序列。 在另一优选例中，所述的P1和P2各自独立地为胰岛素原或胰岛素，较佳地为人胰 岛素原或人胰岛素。 在另一优选例中，所述的胰岛素包括长效或速效胰岛素。 在另一优选例中，所述的胰岛素原的第29位的赖氨酸为炔基氧羰基赖氨酸衍生 物、BOC-赖氨酸(叔丁氧羰基-L-赖氨酸)衍生物、脂肪酰化赖氨酸、或其组合。 在另一优选例中，所述的胰岛素原具有SEQ ID NO:19或20所示的氨基酸序列。 在另一优选例中，所述目的肽P2位于(或连接至)所述(X)n的C端。 在另一优选例中，所述的融合蛋白经酶切后，形成第一目的肽和/或第二目的肽。 在另一优选例中，所述的第一目的肽和第二目的肽是相同或不同的。 在另一优选例中，所述的融合蛋白经酶切后，形成第一目的肽和/或第二目的肽， 并且所述的(X)n被切割成长度Lx远小于第一目的肽和/或第二目的肽的长度Lp的短肽。 在另一优选例中，所述的各Lx为1-25个氨基酸。 在另一优选例中，所述的长度Lx与长度Lp的之比为1/2至1/10，较佳地1/3至1/8。 在另一优选例中，所述长度Lp与长度Lx的之差为大于1.3KD。 在另一优选例中，所述的融合蛋白具有选自下组的结构：A1-u8-L2-P2、A1-u9-L2- P2、A1-u2-u3-L2-P2、A1-u4-u5-L2-P2、A1-u8-u9-L2-P2、A1-u3-u5-u7-L2-P2、A1-u1-u2- u3-L2-P2、A1-u1-u2-u3-u4-L2-P2、A1-u3-u4-u6-L2-P2、A1-u4-u7-u10-L2-P2、A1-u3-u4- u7-u10-L2-P2、或A1-u5-EK-u6-L2-P2。 在另一优选例中，所述的融合蛋白具有如SEQ ID NO.:21所示的氨基酸序列。 本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第一 方面所述的融合蛋白。 本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体包括本发明第二方面所述的多核 苷酸。 6 CN 111718417 A 说 明 书 5/15 页 在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、 逆转录病毒载体、转座子、或其组合。 在另一优选例中，所述的载体为质粒，较佳地，所述的载体为pBAD-HisA载体和/或 pEvol-pBpF载体。 本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第三方面 所述的载体、或染色体中整合有外源的本发明第二方面所述的多核苷酸、或表达本发明第 一方面所述的融合蛋白。 在另一优选例中，所述的宿主细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母细胞、昆虫细 胞、哺乳动物细胞或其组合。 在另一优选例中，所述的宿主细胞均不含有所述的第一、第二和第三酶切位点对 应的蛋白酶。 本发明的第五方面，提供了一种制备蛋白的方法，所述方法包括步骤： (a)培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而得到本发明第一方面所述的融合 蛋白。 在另一优选例中，所述方法还包括步骤：(b)纯化步骤(a)中得到的融合蛋白。 在另一优选例中，所述方法还包括对本发明第一方面所述的融合蛋白进行蛋白水 解消化，以从所述融合蛋白释放所述目的肽。 在另一优选例中，所述步骤(c)中用蛋白酶对本发明第一方面所述的融合蛋白进 行酶切，从而获得酶切产物；和任选地 (d)从酶切产物中分离或纯化出所述的目的肽。 在另一优选例中，所述纯化包括对所述的目的肽通过凝胶过滤或HPLC进一步纯 化。 本发明的第六方面，提供了如本发明第一方面所述的融合蛋白、或本发明第二方 面所述的多核苷酸、或本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面所述的宿主细胞的 用途，所述融合蛋白用于表达制备目的肽。 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。 附图说明 图1显示了正确形成二硫键的成熟胰岛素的结构。 图2显示了重组人胰岛素融合蛋白表达质粒图谱。 图3显示了重组人胰岛素融合蛋白示意图。 图4显示了BOC-赖氨酸结构。 图5显示了重组融合蛋白表达。泳道1，A1-u4-u5-TEV-R-MiniINS融合蛋白的表达， 分子量11.2kD；泳道2，A1-u4-u5-TEV-R-GLP1融合蛋白的表达，分子量8.7kD；泳道3，A1-u8- TEV-R-MiniINS融合蛋白的表达，分子量10.0kD；泳道4，A1-u3-u5-u7-TEV-R-MiniINS融合 蛋白的表达，分子量12.2kD；泳道5，A1-u5-EK-u6-TEV-R-MiniINS融合蛋白的表达，分子量 12.0kD；M为蛋白质分子质量标准。 7 CN 111718417 A 说 明 书 6/15 页
本发明涉及含有荧光蛋白片段的融合蛋白及其用途。具体地，本发明提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白具有(P1‑L1)s‑A1‑(X)n‑A2‑(L2‑P2)t所示的结构。所述融合蛋白中的(X)n或A1‑(X)n，可促进融合目的肽的折叠和表达，并且可提高融合蛋白的溶解性并降低融合蛋白的分 全部
背景技术：
肽是一类生物分子，其被广泛地在许多生物医学研究领域中用作试剂、在疾病的 治疗中用作治疗性药物、在检测病原菌中用作诊断剂以及用作生物标记物。合成肽通常有 两种方法，一种是化学合成，另外一种是重组表达。化学合成已被用于制备多种治疗性肽， 包括可的瑞林、甲状旁腺素(PTH)、胰高血糖素样肽(GLP-1)及其衍生物艾塞那肽和利拉鲁 肽、恩夫韦肽、降血钙素、比伐卢定、齐考诺肽、舍莫瑞林、生长瑞林、分泌素、替度鲁肽和胰 岛素。该方法需要氨基酸片段的多步缩合而形成肽，同时也需要繁琐的保护、去保护和纯化 等步骤。到目前为止，大多数低于50个氨基酸残基的商业化肽是用这种方法生产。由于制药 行业和生物医学研究中肽的需求在不断增加，用于化学合成的氨基酸片段的价格也在持续 攀升。因此，日常使用的治疗性肽药物比如GLP-1类似物，在未来将难以保持可以承受的价 格。尽管化学合成小于50个氨基酸残基的肽在技术上是可行的，但较低的产量以及合成过 程中产生的大量的有机废物是相当不合算的。现在，大多数超过50个氨基酸残基的肽是在 细菌、酵母、昆虫、哺乳动物等细胞宿主中重组表达的。多年来，使用融合蛋白表达多肽一直 是比较常用的方法。但是，用于肽表达的现在可用的融合蛋白方法存在许多技术上的问题， 尤其是对于产生小于50个氨基酸残基的肽。例如现有技术中的融合蛋白分子量大，疏水性 强，很难分离，目标蛋白的比重低，融合比低，结构稳定，难以酶切，上样离子柱、疏水柱死体 积很多。 因此，非常有必要研发一种新的用于表达目的肽的融合蛋白，克服现有融合蛋白 的限制，同时能够提高插入非天然氨基酸蛋白的产生，如提高带有BOC-赖氨酸蛋白等非天 然氨基酸蛋白的产量。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种新的用于表达目的肽的融合蛋白，同时能够提高插入非 天然氨基酸蛋白的产生，如提高带有BOC-赖氨酸蛋白等非天然氨基酸蛋白的产量。 本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括式I所示的结构： (P1-L1)s-A1-(X)n-A2-(L2-P2)t (I) 式中， “-”为肽键或连接肽， 各个P1各自独立地为第一目的肽； 各个P2各自独立地为第二目的肽； 各个L1各自独立地为无或第一连接肽； 各个L2各自独立地为无或第二连接肽； A1为无或信号肽； 3 CN 111718417 A 说 明 书 2/15 页 A2为无或信号肽； 各X独立地为荧光蛋白的单个β-折叠单元； n为1-8的正整数； s为0、1、或2； t为0、1、或2；以及 附加条件是s和t不同时为0。 在另一优选例中，s为0，而t为1。 在另一优选例中，s为1，而t为0。 在另一优选例中，所述n为1-6，较佳地，n为2-4。 在另一优选例中，所述A1为信号肽，A2为无。 在另一优选例中，所述的β-折叠单元选自下组：荧光蛋白的β-折叠单元u1、u2、u3、 u4、u5、u6、u7、u8、u9、u10和u11。 在另一优选例中，所述的各X的长度为10-14aa。 在另一优选例中，各X是不同的。 在另一优选例中，各X是相同的。 在另一优选例中，所述的荧光蛋白选自下组：绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白 (YFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、青色荧光蛋白基因(CFP)、或其组合。 在另一优选例中，所述的荧光蛋白为绿色荧光蛋白(GFP)。 在另一优选例中，所述GFP具有如SEQ ID NO.:13所示的氨基酸序列。 在另一优选例中，所述的任意两个β-折叠单元之间具有或不具有柔性接头I。 在另一优选例中，所述的(X)n作为蛋白表达促进元件。 在另一优选例中，所述的(X)n的总长度Ln为荧光蛋白总长度L0的15-70％，较佳地 20-60％，更佳地25-50％。 在另一优选例中，所述的X选自下组： uj，其具有SEQ ID NO.:j所示的氨基酸序列； 其中，j为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或11。 在另一优选例中，所述的X选自下组： X 氨基酸序列 u1 VPILVELDGDVNG(SEQ ID NO.:1) u2 HKFSVRGEGEGDAT(SEQ ID NO.:2) u3 KLTLKFICTT(SEQ ID NO.:3) u4 YVQERTISFKD(SEQ ID NO.:4) u5 TYKTRAEVKFEGD(SEQ ID NO.:5) u6 TLVNRIELKGIDF(SEQ ID NO.:6) u7 HNVYITADKQ(SEQ ID NO.:7) u8 GIKANFKIRHNVED(SEQ ID NO.:8) u9 VQLADHYQQNTPIG(SEQ ID NO.:9) u10 HYLSTQSVLSKD(SEQ ID NO.:10) 4 CN 111718417 A 说 明 书 3/15 页 u11 HMVLLEFVTAAGI(SEQ ID NO.:11) 在另一优选例中，所述X还包括如SEQ ID NO.:1-11中任一所示序列中的R、K、H相 互替换产生的氨基酸序列；和/或 所述X还包括如SEQ ID NO.:1-11中任一所示的序列中的P、Q相互替换形成的氨基 酸序列；和/或 所述X还包括如SEQ ID NO.:1-11中任一所示的序列中的T、S相互替换形成的氨基 酸序列。 在另一优选例中，所述X选自下组： (A)具有SEQ ID NO:1-11任一所示氨基酸序列的多肽； (B)具有与SEQ ID NO:1-11任一所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地≥85％，更 优选地≥90％，更优选地≥95％，最优选地≥97％的同源性)且保留所述特性的多肽； (C)将SEQ ID NO:1-11任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或 添加而形成的，且保留所述特性的衍生多肽。 在另一优选例中，所述(X)n为u8、u9、u2-u3、u4-u5、u8-u9、u1-u2-u3、u2-u3-u4、 u3-u4-u5、u5-u6-u7、u8-u9-u10、u9-u10-u11、u3-u5-u7、u3-u4-u6、u4-u7-u10、u6-u8-u10、 u1-u2-u3-u4、u2-u3-u4-u5、u3-u4-u3-u4、u3-u5-u7-u9、u5-u6-u7-u8、u1-u3-u7-u9、u2- u2-u7-u8、u7-u2-u5-u11、u3-u4-u7-u10、u1-I-u2、u1-I-u5、u2-I-u4、u3-I-u8、u5-I-u6、或 u10-I-u11。 在另一优选例中，所述A1或A2具有如SEQ ID NO.:12(MVSKGEELFTGV)所示的氨基 酸序列。 在另一优选例中，所述A1-(X)n具有如SEQ ID NO .:14、15、16、17、22、23、24、26、 27、28、29或30所示的氨基酸序列。 在另一优选例中，第一连接肽含有第一酶切位点(如TEV酶切位点)。 在另一优选例中，第二连接肽含有第二酶切位点。 在另一优选例中，所述的柔性接头I中含有第三酶切位点。 在另一优选例中，所述第三酶切位点为肠激酶(较佳地为EK酶)酶切位点，较佳地 为DDDDK(SEQ ID NO.:25)。 在另一优选例中，所述(X)n为u1-EK-u2、u1-EK-u5、u2-EK-u4、u3-EK-u8、u5-EK- u6、或u10-EK-u11,其中EK为EK酶酶切位点。 在另一优选例中，所述的第一、第二和第三酶切位点是各不相同的。 在另一优选例中，所述的第一、第二和第三酶切位点中有两个或三个是相同的。 在另一优选例中，在P1和P2中均不存在所述的第一、第二和第三酶切位点。 在另一优选例中，所述第一连接肽和/或第二连接肽还含有不同于第一、第二和第 三酶切位点的酶切位点。 在另一优选例中，所述第一连接肽和/或第二连接肽含有胰蛋白酶酶切位点，较佳 地，所述第一连接肽和/或第二连接肽含有至少一个精氨酸(R)或赖氨酸(K)。 在另一优选例中，所述第一连接肽的C末端的氨基酸为Arg或Lys。 在另一优选例中，所述第二连接肽的N末端的氨基酸为Arg或Lys。 在另一优选例中，所述第一连接肽和/或第二连接肽还含有烟草蚀纹病毒蛋白酶 5 CN 111718417 A 说 明 书 4/15 页 识别序列。 在另一优选例中，所述第一连接肽和/或第二连接肽具有如SEQ ID NO.:18所示的 氨基酸序列。 在另一优选例中，所述第一连接肽和/或第二连接肽还含有协助表达和/或纯化的 标签序列。 在另一优选例中，所述标签序列为组氨酸标签，较佳地为6×HIS标签。 在另一优选例中，所述的P1和P2各自独立地选自：人胰岛素前体蛋白、赖脯胰岛素 的前体蛋白、甘精胰岛素的前体蛋白、甲状旁腺素、可的瑞琳、降血钙素、比伐卢定、胰高血 糖素样肽及其衍生物艾塞那肽和利拉鲁肽、齐考诺肽、舍莫瑞林、生长瑞林、分泌素、替度鲁 肽、水蛭素、生长激素、生长因子、生长激素释放因子、促肾上腺皮质激素、释放因子、德舍瑞 林、去氨加压素、依降钙素、胰高血糖素、亮丙瑞林、促黄体激素释放激素、生长激素抑制素、 促甲状腺激素释放激素、曲普瑞林、血管活性肠肽、干扰素、甲状旁腺激素、BH3肽、淀粉样变 肽、或上述各肽的片段、或其组合，优选于但不限于上述多肽。 在另一优选例中，所述的P1和P2各自独立地为带有非天然氨基酸的蛋白。 在另一优选例中，所述的P1和P2各自独立地具有长度10-200个氨基酸的序列，较 佳地，具有长度10-80个氨基酸的序列。 在另一优选例中，所述的P1和P2各自独立地为胰岛素原或胰岛素，较佳地为人胰 岛素原或人胰岛素。 在另一优选例中，所述的胰岛素包括长效或速效胰岛素。 在另一优选例中，所述的胰岛素原的第29位的赖氨酸为炔基氧羰基赖氨酸衍生 物、BOC-赖氨酸(叔丁氧羰基-L-赖氨酸)衍生物、脂肪酰化赖氨酸、或其组合。 在另一优选例中，所述的胰岛素原具有SEQ ID NO:19或20所示的氨基酸序列。 在另一优选例中，所述目的肽P2位于(或连接至)所述(X)n的C端。 在另一优选例中，所述的融合蛋白经酶切后，形成第一目的肽和/或第二目的肽。 在另一优选例中，所述的第一目的肽和第二目的肽是相同或不同的。 在另一优选例中，所述的融合蛋白经酶切后，形成第一目的肽和/或第二目的肽， 并且所述的(X)n被切割成长度Lx远小于第一目的肽和/或第二目的肽的长度Lp的短肽。 在另一优选例中，所述的各Lx为1-25个氨基酸。 在另一优选例中，所述的长度Lx与长度Lp的之比为1/2至1/10，较佳地1/3至1/8。 在另一优选例中，所述长度Lp与长度Lx的之差为大于1.3KD。 在另一优选例中，所述的融合蛋白具有选自下组的结构：A1-u8-L2-P2、A1-u9-L2- P2、A1-u2-u3-L2-P2、A1-u4-u5-L2-P2、A1-u8-u9-L2-P2、A1-u3-u5-u7-L2-P2、A1-u1-u2- u3-L2-P2、A1-u1-u2-u3-u4-L2-P2、A1-u3-u4-u6-L2-P2、A1-u4-u7-u10-L2-P2、A1-u3-u4- u7-u10-L2-P2、或A1-u5-EK-u6-L2-P2。 在另一优选例中，所述的融合蛋白具有如SEQ ID NO.:21所示的氨基酸序列。 本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第一 方面所述的融合蛋白。 本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体包括本发明第二方面所述的多核 苷酸。 6 CN 111718417 A 说 明 书 5/15 页 在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、 逆转录病毒载体、转座子、或其组合。 在另一优选例中，所述的载体为质粒，较佳地，所述的载体为pBAD-HisA载体和/或 pEvol-pBpF载体。 本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第三方面 所述的载体、或染色体中整合有外源的本发明第二方面所述的多核苷酸、或表达本发明第 一方面所述的融合蛋白。 在另一优选例中，所述的宿主细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母细胞、昆虫细 胞、哺乳动物细胞或其组合。 在另一优选例中，所述的宿主细胞均不含有所述的第一、第二和第三酶切位点对 应的蛋白酶。 本发明的第五方面，提供了一种制备蛋白的方法，所述方法包括步骤： (a)培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而得到本发明第一方面所述的融合 蛋白。 在另一优选例中，所述方法还包括步骤：(b)纯化步骤(a)中得到的融合蛋白。 在另一优选例中，所述方法还包括对本发明第一方面所述的融合蛋白进行蛋白水 解消化，以从所述融合蛋白释放所述目的肽。 在另一优选例中，所述步骤(c)中用蛋白酶对本发明第一方面所述的融合蛋白进 行酶切，从而获得酶切产物；和任选地 (d)从酶切产物中分离或纯化出所述的目的肽。 在另一优选例中，所述纯化包括对所述的目的肽通过凝胶过滤或HPLC进一步纯 化。 本发明的第六方面，提供了如本发明第一方面所述的融合蛋白、或本发明第二方 面所述的多核苷酸、或本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面所述的宿主细胞的 用途，所述融合蛋白用于表达制备目的肽。 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。 附图说明 图1显示了正确形成二硫键的成熟胰岛素的结构。 图2显示了重组人胰岛素融合蛋白表达质粒图谱。 图3显示了重组人胰岛素融合蛋白示意图。 图4显示了BOC-赖氨酸结构。 图5显示了重组融合蛋白表达。泳道1，A1-u4-u5-TEV-R-MiniINS融合蛋白的表达， 分子量11.2kD；泳道2，A1-u4-u5-TEV-R-GLP1融合蛋白的表达，分子量8.7kD；泳道3，A1-u8- TEV-R-MiniINS融合蛋白的表达，分子量10.0kD；泳道4，A1-u3-u5-u7-TEV-R-MiniINS融合 蛋白的表达，分子量12.2kD；泳道5，A1-u5-EK-u6-TEV-R-MiniINS融合蛋白的表达，分子量 12.0kD；M为蛋白质分子质量标准。 7 CN 111718417 A 说 明 书 6/15 页
