技术摘要：
本发明公开了一种复发性流产生物标志物及其应用，属于生物医学技术领域，该用于诊断复发性流产的环状RNA为hsa_circRNA_100737，其在人早孕期RSA绒毛组织中高表达，通过miR‑28‑5p调控IL‑34的表达，通过miR‑28‑5p‑IL‑34轴影响滋养细胞的增殖、侵袭、成管功能；本  全部
背景技术：
复发性流产(recurrent  spontaneous  abortion,RSA)是指发生3次或3次以上妊 娠28周前的胎儿丢失。RSA发生的原因非常复杂、多样，且其发生风险随着流产发生次数的 增加而升高，对母婴的健康、家庭和社会的和谐造成了不容小觑的影响。RSA的病因复杂，包 括遗传因素、解剖异常、免疫功能异常、感染因素、血栓前状态及社会心理因素等。即便是在 辅助生殖技术飞速发展的今天，仍缺乏对之有效的防治策略。做好RSA的防治已经成为目前 生殖医学领域中迫切需要解决的问题，而解析引发RSA的分子机制是寻找RSA早期预测与防 治的关键，具有重要的理论和临床意义。 成功妊娠是一个极其复杂的生理过程，妊娠时母体与胎儿之间必然存在着复杂的 分子对话机制，而母胎界面又是母-胎交互对话的关键部位，该部位主要由三类细胞组成： 蜕膜基质细胞(decidual  stromal  cell,DSC)来源于母体，它是蜕膜的主要细胞，能够分泌 多种酶类、激素、细胞因子，调节胎盘的发育和胚泡的着床，并且能作为免疫潜能细胞，参与 抗原提呈，在母胎界面发挥重要的免疫调节作用。蜕膜免疫细胞(decidual  immune  cell, DIC)，它是母胎免疫耐受的细胞基础，通过产生大量的细胞因子和表达特殊的活化标志来 发挥与外周不同的免疫调控作用，形成母胎界面特有的免疫微环境。并且蜕膜免疫细胞能 调控滋养细胞的生长、分化、侵袭来维持正常的妊娠。来源于胚胎的滋养细胞 (trophoblasts，Tros)是唯一直接与母体接触的胎儿细胞，它能够侵袭至母体蜕膜深部，参 与子宫螺旋动脉的重铸，胎盘的发育。它携带有父系HLA抗原，却未引起母体对胚胎的免疫 排斥，说明滋养细胞是母胎免疫调节和母胎交互对话中的重要角色。而一旦滋养细胞的功 能异常，如增殖、侵袭不全，会导致蜕膜螺旋动脉重铸不良，只能到达浅层(蜕膜层)，无法到 达肌层，部分血管平滑肌细胞和内皮细胞未完全消失，螺旋动脉管腔未完全扩大，最终导致 胎盘灌注不良。滋养细胞功能异常也会引起与DIC、DSC的交互对话异常，母胎免疫调节紊 乱，从而发生不良妊娠结局如RSA、子痫前期(Preeclampsia,PE)。 近年来环状RNA(circular  RNA)以其独特的环状结构和生物学功能引起了国内外 学者的关注。真核生物中主要有两种环状RNA：外显子反向剪切形成的环状RNA(circRNA)和 环状内含子RNA(ciRNA)。目前研究最多的环状RNA(circRNA)，通过其前体mRNA的外显子反 向剪切，3'末端和5'末端共价结合形成的闭合环状非编码RNA。由于缺乏5’帽结构和3’端的 poly(A)尾(外切核酸酶的结合位点)，因此能一定程度抵抗外切核酸酶，在特定组织、细胞 中具有稳定的结构和表达。环状RNA具有许多重要的生物学功能，如作为microRNA(miRNA) 的海绵调控靶基因的表达；调节自身基因编码转录；与蛋白质相互作用；翻译多肽或蛋白质 等。研究证实circRNA参与多种自身免疫性疾病和肿瘤的发生发展。胚胎植入和肿瘤发生有 许多相似之处，然而，关于circRNA在妊娠中的作用研究较少，多集中于在PE患者中的表达 变化。干扰circRNA_3286可抑制永生化人早孕绒毛外滋养层细胞HTR8/Svneo的侵袭； 3 CN 111593116 A 说　明　书 2/11 页 CircTRNC18可抑制滋养细胞的迁移和上皮-间质转化，提示circRNA参与调控滋养细胞功 能。已有研究表明早孕期正常妊娠绒毛与RSA绒毛circRNA的表达谱不同：Qian等对RSA患者 和正常早孕者的绒毛组织进行了circRNA微阵列分析，发现RSA患者绒毛中有335个circRNA 表达上调，259个circRNA表达下调。RSA中circRNA的异常表达因何而起，异常表达的 circRNA通过何种方式参与RSA的发生发展，目前没有报道。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种复发性流产生物标志物及其应用，以解决上述现有技术 存在的问题。 本发明通过circNet、circBank、miRTarBase、clipSearch等多个数据库分析，结合 课题组前期正常早孕与RSA患者绒毛组织的RNA-Seq数据，按照circRNA与mRNA在RSA病人中 同时上调或下调，筛选到hsa_circRNA_101319、hsa_circRNA_100737、hsa_circRNA_104804 等5个目标环状RNA。经RT-qPCR验证，本发明发现hsa_circRNA_100737在RSA患者绒毛组织 中显著上调，且真实存在；过表达hsa_circRNA_100737后，HTR8/SVneo的侵袭、增殖、成管能 力被抑制，提示hsa_circRNA_100737调控滋养细胞生物学行为可能在RSA的发生发展中具 有重要作用。 因此，本发明拟以正常早孕妊娠与RSA绒毛组织中差异表达hsa_circRNA_100737 为切入点，探讨hsa_circRNA_100737对滋养细胞生物学行为产生影响及其机制，进一步研 究hsa_circRNA_100737调控滋养细胞功能是否影响母胎免疫耐受，以期能够获得RSA发病 机制，为RSA等疾病的防治提供新的思路。 为此，本发明提供了如下方案： 本发明提供一种用于诊断复发性流产的环状RNA，所述环状RNA为hsa_circRNA_ 100737。 所述hsa_circRNA_100737来源于第11号染色体上的Tollip基因，由Tollip基因的 第2-5外显子反向环化而成。 进一步地，所述hsa_circRNA_100737在人早孕期RSA绒毛组织中高表达。 进一步地，所述hsa_circRNA_100737通过miR-28-5p调控IL-34的表达，通过miR- 28-5p-IL-34影响滋养细胞的增殖、侵袭、成管功能。 本发明还提供一种上述的环状RNA作为诊断复发性流产的生物标志物。 本发明还提供一种治疗复发性流产的药物，包括抑制或沉默hsa_circRNA_100737 表达的物质。 本发明公开了以下技术效果： 本发明表明，cirRNA100737在人早孕期RSA绒毛中高表达，异常调控滋养细胞的功 能，并导致蜕膜免疫细胞表型异常，突破母胎免疫耐受，在RSA发生发展中起重要作用：(1) hsa_circRNA_100737在RSA患者绒毛真实高表达；LPS能上调滋养细胞中hsa_circRNA_ 100737的表达。(2)hsa_circRNA_100737与miR-28-5p结合，调控IL-34的表达，通过miR-28- 5p-IL-34轴抑制滋养细胞的侵袭、增殖、与HUVEC的成管能力。(3)IL-34对蜕膜CD4 T细胞、 CD8 T细胞表型无直接影响，能够直接调控蜕膜巨噬细胞向M1型极化，不影响M2型相关分子 的表达；但IL-34参与了滋养细胞对DIC的训导。(4)hsa_circRNA_100737通过miR-28-5p- 4 CN 111593116 A 说　明　书 3/11 页 IL-34轴异常调控滋养细胞功能，导致蜕膜CD4 T细胞、CD8 T细胞功能紊乱，并且使巨噬细胞 向M1型极化，破坏母胎界面免疫耐受微环境。 附图说明 通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述。 图1为早孕和RSA患者绒毛中的hsa_circRNA_100737表达差异图； 图2为hsa_circRNA_100737的验证与反向连接位点； 图3为hsa_circRNA_100737在正常早孕及RSA滋养细胞中的定位； 图4为hsa_circRNA_100737在HTR8/SVneo中的表达及定位； 图5为不同外界刺激对HTR8/SVneo中hsa_circRNA_100737表达的调节； 图6为过表达或干扰hsa_circRNA_100737对HTR8/SVneo生物学行为的影响； 图7为hsa_circRNA_100737对IL-34的表达调控； 图8为hsa_circRNA_100737通过影响miR-28-5p-IL-34轴来调控HTR8/SVneo的生 物学行为。