技术摘要：
本发明公开了一种抗缪勒氏管激素含量检测的单人份试剂盒及其检测方法，本发明的试剂盒包括至少一根单人份试剂条，单人份试剂条内预置有R1试剂、R2试剂和R3试剂，R1试剂为发光微粒‑抗AMH抗体结合物溶液，R1试剂由经过透析的抗AMH抗体和经活化的发光微粒经偶联和封闭后  全部
背景技术：
抗缪勒管激素(Anti-Müllerian  hormone，AMH)是一种糖蛋白，是由2个完全相同 的72kDa单体以二硫键连接组成的二聚体，属于转化生长因子-β家族。AMH由窦前卵泡和小 窦卵泡的颗粒细胞分泌，可以作为女性生育力的评估指标及卵巢功能衰退的预警信号。在 临床上，AMH可用作“多囊卵巢综合征(PCOS)”、“卵巢功能早衰(POF)”、“卵巢颗粒细胞瘤”等 相关疾病的辅助诊断。 目前，抗缪勒氏管激素(AMH)的常用检测方法有如下几种：酶联免疫分析法 (ELISA)、胶乳增强免疫比浊法和磁微粒化学发光免疫分析法等。 酶联免疫分析法(ELISA)检测灵敏度不够高，检测范围窄，影响因素较多，易造成 假阴性和假阳性。胶乳增强免疫比浊法操作简单、快速，但是灵敏度低、低值重复性差。 磁微粒化学发光免疫分析法，为目前主流的免疫标志物检测分析方法，该方法以 超顺磁微粒为固相分离载体，即让结合状态标记物吸附在微球表面，而游离状态标记物分 布于液相中，再洗涤去除磁微粒表面的游离标记物。由于多次清洗，较容易发生磁微粒脱落 (即丢磁现象)，研究表明，标记免疫分析随机误差主要由分离洗涤过程产生，故该类方法重 复性偏低。此外，多次清洗，也势必造成检测灵敏度的损失。而且清洗后产生的废液，也会增 加实验室的处理负担。 近几年，新兴起了利用光激发化学发光技术进行检测的技术，参见附图1所示，光 激发化学发光技术的原理是通过将发光微粒包被的抗体与生物素标记的配对抗体和样本、 或校准品中的抗原结合形成“三明治”复合物。随后加入连有链霉亲和素(Streptavidin， SA)的感光微粒，在680nm的激发光激发下，发生微粒之间的离子氧的转移，进而产生高能级 的610nm红光，在检测范围内，发光强度与样本中的抗原浓度成正比，通过单光子计数器和 数学拟合将光子数换算为靶分子浓度。光激发化学发光技术具有检测响应速度快的优点。 目前，国内已有利用该项技术进行AMH检测的试剂盒及检测方法的相关报道，但是 AMH的光激发化学发光检测试剂盒的主要市场仍然被国外公司所垄断，究其原因在于，国内 的AMH的光激发化学发光检测试剂盒普遍存在重复性及检测灵敏度较差的缺陷，因而对检 测精度和检测结果造成较大影响。
技术实现要素：
为克服上述缺点，本发明的目的在于提供一种用于抗缪勒氏管激素含量检测的单 人份试剂盒及其检测方法，其检测重复性高，灵敏度好，检测结果可靠。 本发明的目的之一在于，提供一种用于抗缪勒氏管激素含量检测的单人份试剂 盒，其包括至少一根单人份试剂条，在每个所述单人份试剂条内预置有R1试剂、R2试剂和R3 5 CN 111579801 A 说　明　书 2/10 页 试剂，在每个所述单人份试剂条上设置有若干试剂孔，所述试剂孔包括用于容纳R1试剂的 第一试剂孔、用于容纳R2试剂的第二试剂孔、用于容纳R3试剂的第三试剂孔和与激光发生 反应的检测孔，所述检测孔采用不透光材料制成，所述试剂孔还包括用于容纳待检测物的 样本孔，所述R1试剂为发光微粒-抗AMH抗体结合物溶液，所述R1试剂由经过透析的抗AMH抗 体和经活化的发光微粒经偶联和封闭后得到，所述发光微粒按照如下步骤进行活化：将发 光微粒经CB缓冲液清洗后离心并超声混匀后加入用CB缓冲液配制的EDAC溶液和NHS溶液， 混匀，旋转反应后即完成对发光微粒的活化，所述R1试剂的发光微粒的浓度为10-100μg/ ml，所述R2试剂为生物素-抗AMH抗体结合物溶液，所述R3试剂为感光微粒-亲和素结合物溶 液，所述R3试剂的感光微粒的浓度为10-100μg/ml。 进一步的，所述发光微粒的活化方法为,将所述发光微粒利用CB缓冲液清洗后离 心，超声混匀用CB缓冲液分别配制EDAC和NHS溶液，并迅速加入清洗后的发光微粒中，混匀， 即完成对发光微粒的活化。 更进一步的，所述R1试剂按照如下方法制备： ①活化后清洗：将活化完的发光微粒用去离子水离心清洗，离心后用缓冲液重新 悬浮； ②偶联反应：将经活化的发光微粒及经透析处理的抗AMH抗体按质量比10:0 .1- 10:0.8混合，充分旋转反应； ③封闭：利用甘氨酸溶液对发光微粒进行封闭处理； ④清洗：用CB缓冲液清洗步骤③得到的发光微粒-抗AMH抗体结合物； ⑤定容：用HEPES缓冲液对发光微粒-抗AMH抗体结合物定容，备用； ⑥R1试剂配制：将步骤⑤制备得到的发光微粒-抗AMH抗体结合物溶液加入到 HEPES缓冲液中，即配制得到R1试剂。 进一步的，所述R2试剂按照如下步骤制备： ①抗AMH抗体的透析：将抗AMH抗体于CB缓冲液中透析处理，透析完成后使用OD法 进行抗体浓度测定； ②标记反应：用NaHCO3缓冲液将步骤①透析得到的抗AMH抗体稀释，将生物素溶液 加入抗AMH抗体溶液中，旋转反应，即完成标记，生物素与抗AMH抗体的标记比例为20-100个 生物素：1个抗AMH抗体； ③标记后的透析：用CB缓冲液对步骤②得到的生物素标记的抗AMH抗体进行透析； ④浓度测定：收集步骤③得到的抗AMH抗体-生物素结合物溶液，使用OD法进行抗 体蛋白浓度测定； ⑤R2试剂配制：将步骤③制备得到的抗AMH抗体-生物素结合物溶液加入到PB缓冲 液中，即配制得到R2试剂。 更进一步的，所述R3试剂按照如下步骤制备： ①亲和素蛋白透析：将亲和素蛋白于CB缓冲液中透析处理，透析完成后使用OD法 进行蛋白浓度测定； ②感光微粒清洗：将感光微粒用去离子水离心清洗，离心后用HEPES缓冲液重新悬 浮； ③偶联反应：将步骤②得到的感光微粒及步骤①得到的亲和素蛋白按质量比10: 6 CN 111579801 A 说　明　书 3/10 页 0.1-10:0.8混合，保温旋转反应； ④还原：向步骤③所得到的反应液中迅速加入NaBH4溶液，低温旋转反应，感光微 粒与NaBH4的质量比为10:0.05-10:0.5； ⑤封闭：将甘氨酸溶液迅速加入到步骤④得到的反应物中进行封闭处理，感光微 粒与甘氨酸的质量比为1:0.5-1:5； ⑥清洗：用CB缓冲液对步骤⑤得到的感光微粒-亲和素结合物进行清洗； ⑦定容：用HEPES缓冲液将步骤⑥得到的感光微粒-亲和素结合物定容，备用； ⑧R3试剂配制：将步骤⑦制备得到的感光微粒-亲和素结合物溶液加入到HEPES缓 冲液中，即配制得到R3试剂。 本发明的目的之二，在于提供一种非诊断目的的定量检测抗缪勒氏管激素的方 法，其利用前述本发明的目的之一所述的单人份试剂条完成，具体包括如下步骤： ①校准品溶液的配制： 采用胎牛血清(内含1‰Proclin)作为校准品缓冲液，配制不同梯度浓度的AMH校 准品溶液； ②校准品的发光值检测： 将步骤①所得到的不同浓度的校准品分别放入到一根单人份试剂条的样本孔内， 将单人份试剂条放入到分析仪器中进行检测；TIP头从样本孔和第一试剂孔吸取样本和R1 试剂后注入到第二试剂孔，吸打混匀后恒温温育，温育结束后，吸取第二试剂孔中的反应物 和第三试剂孔中的R3试剂，注入到所述检测孔中，吸打混匀后，恒温温育处理； ③标准曲线的拟合： 温育结束后，分析仪器产生激光照射检测孔，计算每孔发光光子量，拟合出样本浓 度-发光值的标准曲线； ④样本检测： 将待测样本放入单人份试剂条的样本孔内，分析仪器重复步骤②的工作过程，得 到样本的发光值，并通过步骤③得到的标准曲线计算出样本中AMH的浓度值。 本发明的目的之三在于，提供一种非诊断目的的定量检测抗缪勒氏管激素的方 法，其包括如下步骤： ①制备R1试剂： (a)抗AMH抗体透析：将抗AMH抗体于CB缓冲液中透析处理，透析完成后使用OD法进 行抗体浓度测定； (b)发光微粒活化：将发光微粒利用CB缓冲液清洗后离心，超声混匀。用CB缓冲液 分别配制EDAC和NHS溶液，并迅速加入清洗后的发光微粒中，混匀，充分旋转反应； (c)活化后清洗：将活化完的发光微粒用去离子水离心清洗，离心后用缓冲液重新 悬浮； (d)偶联反应：将处理好的发光微粒及抗AMH抗体按质量比10:0.1-10:0.8混合，充 分旋转反应； (e)封闭：利用甘氨酸溶液对发光微粒进行封闭处理； (f)清洗：用CB缓冲液清洗步骤(e)得到的发光微粒-抗AMH抗体结合物； (g)定容：用HEPES缓冲液对发光微粒-抗AMH抗体结合物定容，备用； 7 CN 111579801 A 说　明　书 4/10 页 (h)配制R1试剂:将步骤(g)制备得到的发光微粒-抗AMH抗体结合物溶液加入到 HEPES缓冲液中，即配制得到R1试剂。 ②制备R2试剂： (a)抗AMH抗体的透析：将抗AMH抗体于CB缓冲液中透析处理，透析完成后使用OD法 进行抗体浓度测定； (b)标记反应：用NaHCO3缓冲液将步骤(a)透析得到的抗AMH抗体稀释，将生物素溶 液加入抗AMH抗体溶液中，旋转反应，即完成标记，生物素与抗AMH抗体的标记比例为20-100 个生物素：1个抗AMH抗体； (c)标记后的透析：用CB缓冲液对步骤(b)得到的生物素标记的抗AMH抗体进行透 析； (d)浓度测定：收集步骤(c)得到的抗AMH抗体-生物素结合物溶液，使用OD法进行 抗体蛋白浓度测定； (e)R2试剂配制：将步骤(c)制备得到的抗AMH抗体-生物素结合物溶液加入到PB缓 冲液中，即配制得到R2试剂。 ③制备R3试剂： (a)亲和素蛋白透析：将亲和素蛋白于CB缓冲液中透析处理，透析完成后使用OD法 进行蛋白浓度测定； (b)感光微粒清洗：将感光微粒用去离子水离心清洗，离心后用HEPES缓冲液重新 悬浮； (c)偶联反应：将步骤(b)得到的感光微粒及步骤(a)得到的亲和素蛋白按质量比 10:0.1-10:0.8混合，保温旋转反应； (d)还原：向步骤(c)所得到的反应液中迅速加入NaBH4溶液，低温旋转反应，感光 微粒与NaBH4的质量比为10:0.05-10:0.5； (e)封闭：将甘氨酸溶液迅速加入到步骤④得到的反应物中进行封闭处理，感光微 粒与甘氨酸的质量比为1:0.5-1:5； (f)清洗：用CB缓冲液对步骤(e)得到的感光微粒-亲和素结合物进行清洗； (g)定容：用HEPES缓冲液将步骤⑥得到的感光微粒-亲和素结合物定容，备用； (h)R3试剂配制：将步骤(g)制备得到的感光微粒-亲和素结合物溶液加入到HEPES 缓冲液中，即配制得到R3试剂。 ④标准曲线的绘制： 配制不同梯度浓度的校准品溶液；将校准品溶液和R1试剂放入预先存放有R2试剂 的反应容器中，吸打混匀后恒温温育，温育结束后，将经温育和R3试剂于避光的反应容器中 混匀后恒温温育处理，温育结束后，将避光的反应容器放入分析仪器内，分析仪器产生激光 照射其内的反应物，并得到其发光光子量；依次得到各个不同浓度的校准品的发光值，拟合 出样本浓度-发光值的标准曲线； ⑤将待测样本按照上述步骤④中的处理步骤，利用分析仪器得到样本的发光值， 并通过步骤④得到的标准曲线计算出样本中AMH的浓度值。 本发明与现有技术相比具有如下有益效果： ①本发明的试剂盒对抗缪勒氏管激素的检测结果重复性高，经过对高浓度AMH和 8 CN 111579801 A 说　明　书 5/10 页 低浓度AMH质控品的重复检测实验验证，其CV值小于1.5％，检测结果具有良好的检测重复 性。 ②本发明的试剂盒检测结果可靠，其与罗氏诊断的临床相关性r>0.99以上，且对 血浆和全血检测结果具有良好的一致性。 ③本发明的试剂盒的检测结果分析灵敏度高，其检出限≤0.001μg/ml。 ④本发明的检测试剂盒中包含多个单人份检测试剂条，因而具有更佳的使用灵活 性和检测精度。 ⑤利用本发明的检测方法能够实现对AMH的快速、准确的测定，其检测效率高，检 测结果可靠。 附图说明 图1为光激发化学发光技术原理图； 图2为本发明的实施例4中的单人份试剂条的结构示意图； 图3为本发明的实施例6中的AMH浓度-发光值标准曲线； 图4为本发明的实施例10中利用本发明的试剂盒对血浆和全血中的AMH检测结果 的相关性曲线； 图5为本发明的实施例11中利用本发明的试剂盒与市售商品的对AMH进行检测结 果的相关性曲线。 图中： 1-样本孔、2-第一试剂孔、3-第二试剂孔、4-第三试剂孔、5-检测孔、6-空白孔。