技术摘要：
本发明提供了一种针对莪术中强极性成分的分离制备及分离分析方法。首先对莪术的极性组分进行制备，以降低样品复杂性。获得极性组分后，使用反相/亲水二维色谱分析方法进行分析：使用极性共聚的反相XAqua C18色谱柱进行第一维分析，酰胺键合的亲水色谱柱XAmide对其进行 全部
背景技术：
本发明的目的是提供对莪术中强极性成分的分离分析方法或制备方法的开发。 利用二维色谱良好的正交性及显著提高峰容量的特点，对莪术中极性成分分别进 行反相分离与亲水分离，可以使化合物较好的保留并分离，该方法可用于莪术中强极性化 合物的分离分析及制备。 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：将莪术中的强极性成分分离制备后 获得莪术中的强极性成分，然后通过二维RPLC×HILIC正交方法对制备得到的强极性成分 进行分离分析。 第一维采用极性反相色谱柱结合第二维亲水色谱柱的二维色谱分析方法分离分 析莪术中强极性化合物，流动相为乙腈(A)和水(B)，均添加0.05％-0.1％甲酸，紫外检测器 检测波长190-400nm。其中极性反相柱为XAqua C18柱，亲水柱为XAmide柱。色谱操作参数如 下：色谱柱内径为2.1-50mm；样品浓度为1mg/mL-140mg/mL；进样量为5μL-9mL；流速为0.2- 80mL/min；柱温为30℃。 莪术中的强极性成分分离制备操作步骤为： 所述莪术极性组分的制备方法为： 称取3-10千克的莪术块茎切成片，用其5-20倍量的50-90％乙醇溶液加热回流提 取三次，每次回流提取时间为1-3小时，合并提取液后抽滤，在50-70℃真空下旋转蒸发浓缩 体积约至5-10升；依次用3-5倍体积正庚烷和乙酸乙酯洗脱旋蒸浓缩液，得到的乙酸乙酯洗 脱液在真空下进一步干燥，得到样品；采用体积浓度50％-50％甲醇-水混合溶剂溶解样品 至180-220mg/mL的浓度；将溶解后的样品液进行离心，将上清液通过0.45μm膜过滤得到极 性馏分，采用Unitary C18柱(50×265mm，7μm，华谱，中国)对该极性馏分进行制备；制备条 件为：流动相A为0.05％-0.1％甲酸(v/v)水溶液，B为甲醇，梯度洗脱条件设定如下：0分钟 (25％B)-5分钟(30％B)-15分钟(45％B)-40分钟(70％B)-50分钟(95％B)-60分钟(95％B)， 进样量8-10mL，流速为70-90mL/min，在波长190-400nm处记录色谱图并收集基于峰的馏分； 接取接近“死体积”时间出峰馏分，浓缩备用，完成莪术中的强极性成分分离制备。 二维RPLC×HILIC正交方法对制备得到的强极性成分进行分离分析的方法为： 1)莪术强极性组分先经第一维反相高效液相色谱分离，色谱柱为极性共聚的碳十 八柱，洗脱方式为线性梯度洗脱，收集一维制备的馏分； 具体步骤为：制备得莪术强极性组分经第一维极性共聚XAqua C18柱(10× 250mm)、XAqua C18柱(4.6×150mm，5μm)、XCharge C18PN柱(4.6×150mm,5μm)、XBridge柱 (4.6×150mm,5μm)中的一种进行分离。紫外检测器波长选择为190-400nm，进样50-200μL。 流动相由乙腈(A)和水(B)组成，均添加0.05％-0.1％甲酸，梯度洗脱参数：0分钟(0％A)-6 分钟(0％A)-13分钟(2％A)-16分钟(8％A)-17分钟(14％A)-20分钟(24％A)-30分钟(40％ 5 CN 111610284 A 说 明 书 3/4 页 A)-35分钟(70％A)-40分钟(95％A)-45分钟(95％A)，流速为3-3.5mL/min。根据色谱出峰时 间收集馏分，从第3分钟开始，每分钟接取一次馏分，共接取23个一维馏分，氮吹浓缩至1mL 以进行第二维亲水色谱分离。 2)莪术一维制备馏分经第二维亲水高效液相色谱分离，流动相由乙腈(A)和水(B) 组成，均添加0.05％-0.1％甲酸对馏分进行第二维制备，获得极性化合物二维馏分。 具体步骤为： 1)在由2998光电二极管矩阵检测器(Waters，USA)组成的联合HPLC系统上使用 XAmide柱(2.1×250mm，5μm，华谱，中国)、XAmide柱(4.6×150mm，5μm)、Inertsil Diol柱 (4.6×150mm，5μm)、BEH Silica柱(4.6×150mm，5μm)中的一种对23个一维馏分进行第二维 分析。流动相由乙腈(A)和水(B)组成，均添加0.05％-0.1％甲酸。梯度洗脱条件设置为：0分 钟(98％A)-12分钟(98％A)-13分钟(92％A)-30分钟(75％A)-40分钟(50％A)-50分钟(5％ A)-55分钟(5％A)。流速为0.2mL/min。在190-400nm处记录色谱图。 本发明的方法可以应用于莪术中强极性成分的分离制备及分离分析中。 该发明优点 提供了莪术中强极性化合物的离线反相/亲水二维色谱分析方法，对反相上保留 较弱或者没有保留的化合物提供了很好的分离效果。该方法解决了极性化合物在常规色谱 填料上的弱保留问题，可以实现莪术中强极性化合物的高效制备，为其他天然产物、生物样 品以及药物制剂中极性化合物的分离纯化提供了良好的技术方案。 附图说明 图1为本发明极性馏分收集色谱图(λ＝254nm)； 图2为本发明反相色谱柱筛选色谱图(λ＝254nm)(a)XAqua C18(b)XCharge C18PN (c)XBridge C18； 图3为本发明反相流动相考察色谱图(λ＝254nm)流动相(a)乙腈(b)甲醇； 图4为本发明一维反相制备色谱图(λ＝254nm)； 图5为本发明亲水色谱柱筛选色谱图(λ＝254nm)(a)XAmide(b)Inertsil Diol(c) BEH Silica； 图6为本发明亲水流动相考察色谱图(λ＝254nm)流动相：(a)不加盐(b)5mM甲酸铵 (c)10mM甲酸铵； 图7为本发明莪术23个极性馏分的三维色谱图(λ＝254nm)。
技术实现要素：
现结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限 定。 实施例1：极性馏分的提取和制备 称取5千克的莪术块茎切成片，用10倍量的70％乙醇溶液加热回流提取三次，每次 回流提取时间为2小时，合并提取液后抽滤，在60℃真空下旋转蒸发浓缩体积约至5.7升。依 次用正庚烷(3×5.7L)和乙酸乙酯(5×5.7L)洗脱旋蒸浓缩液。得到的乙酸乙酯洗脱液在真 空下进一步干燥，采用体积浓度50％-50％甲醇-水混合溶剂溶解样品至200mg/mL的浓度。 6 CN 111610284 A 说 明 书 4/4 页 离心，将上清液通过0.45μm膜过滤，采用Unitary C18柱(50×265mm，7μm，华谱，中国)对该 极性馏分进行制备。流动相A为0.1％甲酸(v/v)水溶液，B为甲醇。梯度洗脱条件设定如下：0 分钟(25％B)-5分钟(30％B)-15分钟(45％B)-40分钟(70％B)-50分钟(95％B)-60分钟 (95％B)。进样量9mL，流速为80mL/min。在254nm处记录色谱图并收集基于峰的馏分。接取接 近“死体积”时间出峰馏分，浓缩备用，作为莪术的极性成分。收集极性馏分结果见图1。考虑 样品的溶解性因素，第一维选择反相分析，第二维选择亲水分析。 实施例2：反相色谱分离条件优化 考察不同反相色谱柱出峰情况：XAqua C18柱(4.6×150mm，5μm)、XCharge C18PN 柱(4.6×150mm ,5μm)、XBridge柱(4.6×150mm ,5μm)。样品：制备得极性馏分。流动相A为 0.1％甲酸(v/v)乙腈溶液，B为0.1％甲酸(v/v)水。梯度洗脱设定如下：0分钟(0％A)-6分钟 (0％A)-13分钟(2％A)-16分钟(8％A)-17分钟(14％A)-20分钟(24％A)-30分钟(40％A)-35 分钟(70％A)-40分钟(95％A)-45分钟(95％A)。流速为1.0mL/min。在254nm处记录色谱图。 反相柱筛选结果见图2。反相色谱流动相筛选：梯度条件同上，将流动相更换为A:0.1％甲酸 (v/v)甲醇，B：0.1％甲酸(v/v)水。流速为1.0mL/min。在254nm处记录色谱图。结果见图3。色 谱图出峰无明显区别，考虑后续二维亲水色谱分析，甲醇为强洗脱溶剂，最终选定流动相为 A:0.1％甲酸(v/v)乙腈，B：0.1％甲酸(v/v)水。 实施例3：亲水作用色谱分离条件优化 考察不同亲水色谱柱出峰情况：XAmide柱(4.6×150mm，5μm)、Inertsil Diol柱 (4.6×150mm，5μm)、BEH Silica柱(4.6×150mm，5μm)。梯度洗脱设定如下：0分钟(98％A)- 12分钟(98％A)-13分钟(92％A)-30分钟(75％A)-40分钟(50％A)-50分钟(5％A)-55分钟 (5％A)。流速为1.0mL/min。在254nm处记录色谱图。亲水柱筛选结果见图5。亲水色谱流动相 筛选：考察流动相添加不同浓度盐条件下，亲水色谱分离情况，流动相A:0.1％甲酸(v/v)乙 腈，B：0.1％甲酸(v/v)水，C：100mM甲酸铵。在254nm下记录5mM甲酸铵(C:5％)、10mM甲酸铵 (C:10％)条件下色谱图。结果见图6。 实施例4：莪术极性成分的一维反相色谱分离 制备得莪术强极性组分经第一维极性共聚XAqua C18柱(10×250mm)进行分离制 备。检测器波长选择为254nm，进样100μL。流动相为权利要求1中所述流动相。梯度洗脱参 数：0分钟(0％A)-6分钟(0％A)-13分钟(2％A)-16分钟(8％A)-17分钟(14％A)-20分钟 (24％A)-30分钟(40％A)-35分钟(70％A)-40分钟(95％A)-45分钟(95％A)。流速为3.3mL/ min。一维制备结果见图4。根据色谱出峰时间收集馏分，从第3分钟开始，每分钟接取一次馏 分，共接取23个一维馏分。氮吹浓缩至1mL以进行第二维亲水色谱分离。 实施例5：莪术极性成分的二维亲水作用色谱分离分析 活性级分由2998光电二极管矩阵检测器(Waters，USA)组成的联合HPLC系统，在 XAmide柱(2.1×150mm，5μm)上进行进行二维HPLC分析。流动相A:0.1％甲酸(v/v)乙腈，B： 0.1％甲酸(v/v)水。梯度洗脱设定如下：0分钟(98％A)-12分钟(98％A)-13分钟(92％A)-30 分钟(75％A)-40分钟(50％A)-50分钟(5％A)-55分钟(5％A)。流速为0.2mL/min。在254nm处 记录色谱图。结果见图7。 7 CN 111610284 A 说 明 书 附 图 1/5 页 图1 图2 8 CN 111610284 A 说 明 书 附 图 2/5 页 图3 9 CN 111610284 A 说 明 书 附 图 3/5 页 图4 10 CN 111610284 A 说 明 书 附 图 4/5 页 图5 11 CN 111610284 A 说 明 书 附 图 5/5 页 图6 图7 12
本发明提供了一种针对莪术中强极性成分的分离制备及分离分析方法。首先对莪术的极性组分进行制备，以降低样品复杂性。获得极性组分后，使用反相/亲水二维色谱分析方法进行分析：使用极性共聚的反相XAqua C18色谱柱进行第一维分析，酰胺键合的亲水色谱柱XAmide对其进行 全部
背景技术：
本发明的目的是提供对莪术中强极性成分的分离分析方法或制备方法的开发。 利用二维色谱良好的正交性及显著提高峰容量的特点，对莪术中极性成分分别进 行反相分离与亲水分离，可以使化合物较好的保留并分离，该方法可用于莪术中强极性化 合物的分离分析及制备。 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：将莪术中的强极性成分分离制备后 获得莪术中的强极性成分，然后通过二维RPLC×HILIC正交方法对制备得到的强极性成分 进行分离分析。 第一维采用极性反相色谱柱结合第二维亲水色谱柱的二维色谱分析方法分离分 析莪术中强极性化合物，流动相为乙腈(A)和水(B)，均添加0.05％-0.1％甲酸，紫外检测器 检测波长190-400nm。其中极性反相柱为XAqua C18柱，亲水柱为XAmide柱。色谱操作参数如 下：色谱柱内径为2.1-50mm；样品浓度为1mg/mL-140mg/mL；进样量为5μL-9mL；流速为0.2- 80mL/min；柱温为30℃。 莪术中的强极性成分分离制备操作步骤为： 所述莪术极性组分的制备方法为： 称取3-10千克的莪术块茎切成片，用其5-20倍量的50-90％乙醇溶液加热回流提 取三次，每次回流提取时间为1-3小时，合并提取液后抽滤，在50-70℃真空下旋转蒸发浓缩 体积约至5-10升；依次用3-5倍体积正庚烷和乙酸乙酯洗脱旋蒸浓缩液，得到的乙酸乙酯洗 脱液在真空下进一步干燥，得到样品；采用体积浓度50％-50％甲醇-水混合溶剂溶解样品 至180-220mg/mL的浓度；将溶解后的样品液进行离心，将上清液通过0.45μm膜过滤得到极 性馏分，采用Unitary C18柱(50×265mm，7μm，华谱，中国)对该极性馏分进行制备；制备条 件为：流动相A为0.05％-0.1％甲酸(v/v)水溶液，B为甲醇，梯度洗脱条件设定如下：0分钟 (25％B)-5分钟(30％B)-15分钟(45％B)-40分钟(70％B)-50分钟(95％B)-60分钟(95％B)， 进样量8-10mL，流速为70-90mL/min，在波长190-400nm处记录色谱图并收集基于峰的馏分； 接取接近“死体积”时间出峰馏分，浓缩备用，完成莪术中的强极性成分分离制备。 二维RPLC×HILIC正交方法对制备得到的强极性成分进行分离分析的方法为： 1)莪术强极性组分先经第一维反相高效液相色谱分离，色谱柱为极性共聚的碳十 八柱，洗脱方式为线性梯度洗脱，收集一维制备的馏分； 具体步骤为：制备得莪术强极性组分经第一维极性共聚XAqua C18柱(10× 250mm)、XAqua C18柱(4.6×150mm，5μm)、XCharge C18PN柱(4.6×150mm,5μm)、XBridge柱 (4.6×150mm,5μm)中的一种进行分离。紫外检测器波长选择为190-400nm，进样50-200μL。 流动相由乙腈(A)和水(B)组成，均添加0.05％-0.1％甲酸，梯度洗脱参数：0分钟(0％A)-6 分钟(0％A)-13分钟(2％A)-16分钟(8％A)-17分钟(14％A)-20分钟(24％A)-30分钟(40％ 5 CN 111610284 A 说 明 书 3/4 页 A)-35分钟(70％A)-40分钟(95％A)-45分钟(95％A)，流速为3-3.5mL/min。根据色谱出峰时 间收集馏分，从第3分钟开始，每分钟接取一次馏分，共接取23个一维馏分，氮吹浓缩至1mL 以进行第二维亲水色谱分离。 2)莪术一维制备馏分经第二维亲水高效液相色谱分离，流动相由乙腈(A)和水(B) 组成，均添加0.05％-0.1％甲酸对馏分进行第二维制备，获得极性化合物二维馏分。 具体步骤为： 1)在由2998光电二极管矩阵检测器(Waters，USA)组成的联合HPLC系统上使用 XAmide柱(2.1×250mm，5μm，华谱，中国)、XAmide柱(4.6×150mm，5μm)、Inertsil Diol柱 (4.6×150mm，5μm)、BEH Silica柱(4.6×150mm，5μm)中的一种对23个一维馏分进行第二维 分析。流动相由乙腈(A)和水(B)组成，均添加0.05％-0.1％甲酸。梯度洗脱条件设置为：0分 钟(98％A)-12分钟(98％A)-13分钟(92％A)-30分钟(75％A)-40分钟(50％A)-50分钟(5％ A)-55分钟(5％A)。流速为0.2mL/min。在190-400nm处记录色谱图。 本发明的方法可以应用于莪术中强极性成分的分离制备及分离分析中。 该发明优点 提供了莪术中强极性化合物的离线反相/亲水二维色谱分析方法，对反相上保留 较弱或者没有保留的化合物提供了很好的分离效果。该方法解决了极性化合物在常规色谱 填料上的弱保留问题，可以实现莪术中强极性化合物的高效制备，为其他天然产物、生物样 品以及药物制剂中极性化合物的分离纯化提供了良好的技术方案。 附图说明 图1为本发明极性馏分收集色谱图(λ＝254nm)； 图2为本发明反相色谱柱筛选色谱图(λ＝254nm)(a)XAqua C18(b)XCharge C18PN (c)XBridge C18； 图3为本发明反相流动相考察色谱图(λ＝254nm)流动相(a)乙腈(b)甲醇； 图4为本发明一维反相制备色谱图(λ＝254nm)； 图5为本发明亲水色谱柱筛选色谱图(λ＝254nm)(a)XAmide(b)Inertsil Diol(c) BEH Silica； 图6为本发明亲水流动相考察色谱图(λ＝254nm)流动相：(a)不加盐(b)5mM甲酸铵 (c)10mM甲酸铵； 图7为本发明莪术23个极性馏分的三维色谱图(λ＝254nm)。
技术实现要素：
现结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限 定。 实施例1：极性馏分的提取和制备 称取5千克的莪术块茎切成片，用10倍量的70％乙醇溶液加热回流提取三次，每次 回流提取时间为2小时，合并提取液后抽滤，在60℃真空下旋转蒸发浓缩体积约至5.7升。依 次用正庚烷(3×5.7L)和乙酸乙酯(5×5.7L)洗脱旋蒸浓缩液。得到的乙酸乙酯洗脱液在真 空下进一步干燥，采用体积浓度50％-50％甲醇-水混合溶剂溶解样品至200mg/mL的浓度。 6 CN 111610284 A 说 明 书 4/4 页 离心，将上清液通过0.45μm膜过滤，采用Unitary C18柱(50×265mm，7μm，华谱，中国)对该 极性馏分进行制备。流动相A为0.1％甲酸(v/v)水溶液，B为甲醇。梯度洗脱条件设定如下：0 分钟(25％B)-5分钟(30％B)-15分钟(45％B)-40分钟(70％B)-50分钟(95％B)-60分钟 (95％B)。进样量9mL，流速为80mL/min。在254nm处记录色谱图并收集基于峰的馏分。接取接 近“死体积”时间出峰馏分，浓缩备用，作为莪术的极性成分。收集极性馏分结果见图1。考虑 样品的溶解性因素，第一维选择反相分析，第二维选择亲水分析。 实施例2：反相色谱分离条件优化 考察不同反相色谱柱出峰情况：XAqua C18柱(4.6×150mm，5μm)、XCharge C18PN 柱(4.6×150mm ,5μm)、XBridge柱(4.6×150mm ,5μm)。样品：制备得极性馏分。流动相A为 0.1％甲酸(v/v)乙腈溶液，B为0.1％甲酸(v/v)水。梯度洗脱设定如下：0分钟(0％A)-6分钟 (0％A)-13分钟(2％A)-16分钟(8％A)-17分钟(14％A)-20分钟(24％A)-30分钟(40％A)-35 分钟(70％A)-40分钟(95％A)-45分钟(95％A)。流速为1.0mL/min。在254nm处记录色谱图。 反相柱筛选结果见图2。反相色谱流动相筛选：梯度条件同上，将流动相更换为A:0.1％甲酸 (v/v)甲醇，B：0.1％甲酸(v/v)水。流速为1.0mL/min。在254nm处记录色谱图。结果见图3。色 谱图出峰无明显区别，考虑后续二维亲水色谱分析，甲醇为强洗脱溶剂，最终选定流动相为 A:0.1％甲酸(v/v)乙腈，B：0.1％甲酸(v/v)水。 实施例3：亲水作用色谱分离条件优化 考察不同亲水色谱柱出峰情况：XAmide柱(4.6×150mm，5μm)、Inertsil Diol柱 (4.6×150mm，5μm)、BEH Silica柱(4.6×150mm，5μm)。梯度洗脱设定如下：0分钟(98％A)- 12分钟(98％A)-13分钟(92％A)-30分钟(75％A)-40分钟(50％A)-50分钟(5％A)-55分钟 (5％A)。流速为1.0mL/min。在254nm处记录色谱图。亲水柱筛选结果见图5。亲水色谱流动相 筛选：考察流动相添加不同浓度盐条件下，亲水色谱分离情况，流动相A:0.1％甲酸(v/v)乙 腈，B：0.1％甲酸(v/v)水，C：100mM甲酸铵。在254nm下记录5mM甲酸铵(C:5％)、10mM甲酸铵 (C:10％)条件下色谱图。结果见图6。 实施例4：莪术极性成分的一维反相色谱分离 制备得莪术强极性组分经第一维极性共聚XAqua C18柱(10×250mm)进行分离制 备。检测器波长选择为254nm，进样100μL。流动相为权利要求1中所述流动相。梯度洗脱参 数：0分钟(0％A)-6分钟(0％A)-13分钟(2％A)-16分钟(8％A)-17分钟(14％A)-20分钟 (24％A)-30分钟(40％A)-35分钟(70％A)-40分钟(95％A)-45分钟(95％A)。流速为3.3mL/ min。一维制备结果见图4。根据色谱出峰时间收集馏分，从第3分钟开始，每分钟接取一次馏 分，共接取23个一维馏分。氮吹浓缩至1mL以进行第二维亲水色谱分离。 实施例5：莪术极性成分的二维亲水作用色谱分离分析 活性级分由2998光电二极管矩阵检测器(Waters，USA)组成的联合HPLC系统，在 XAmide柱(2.1×150mm，5μm)上进行进行二维HPLC分析。流动相A:0.1％甲酸(v/v)乙腈，B： 0.1％甲酸(v/v)水。梯度洗脱设定如下：0分钟(98％A)-12分钟(98％A)-13分钟(92％A)-30 分钟(75％A)-40分钟(50％A)-50分钟(5％A)-55分钟(5％A)。流速为0.2mL/min。在254nm处 记录色谱图。结果见图7。 7 CN 111610284 A 说 明 书 附 图 1/5 页 图1 图2 8 CN 111610284 A 说 明 书 附 图 2/5 页 图3 9 CN 111610284 A 说 明 书 附 图 3/5 页 图4 10 CN 111610284 A 说 明 书 附 图 4/5 页 图5 11 CN 111610284 A 说 明 书 附 图 5/5 页 图6 图7 12
