技术摘要：
本发明提供了一种测定土壤脂肪酸甲酯的定量方法及其应用，本发明利用37种脂肪酸甲酯混合标准品作为外标，在GC‑MS上确定运行参数，建立测定脂肪酸甲酯的方法，采用十九烷酸甲酯内标和37种脂肪酸甲酯外标的混合溶液确定外标中脂肪酸甲酯的校正因子，提取土壤中磷脂脂肪  全部
背景技术：
磷脂脂肪酸(PLFAs)是细胞膜的组成成分之一，由于不同种类微生物所含有的 PLFAs的种类不同，利用PLFAs的组成来表征土壤微生物群落结构已被广泛应用。为了提高 待测物质的稳定性以及降低其沸点使其更容易气化，一般需要将PLFAs衍生化为相应的甲 酯，即脂肪酸甲酯FAME，然后测试其成分和含量。测定FAME的常用仪器包括气象色谱仪、气 相色谱-质谱联用仪、液相色谱-质谱联用仪，其中，美国MIDI公司开发的Sherlock  Microbial  Identification  System(MIS)就是在气象色谱仪的平台上(如Agilent公司的 GC-6850,7820,6890和7890)对微生物中特定短链脂肪酸(C9-C20)形成FAME的种类和含量 进行鉴定和分析的软件。尽管利用该软件能对大批量样品进行快速检测，但仍存在数据库 中缺少待检测的FAME以及色谱峰误判的情况，并且购买MIDI软件的费用相对比较昂贵。液 相色谱-质谱联用仪能够分析FAME的极性磷酸头部，也能够分析FAME的非极性脂肪酸侧链， 能展示最初活体细胞膜磷脂分子所承载的全部信息。但是，由于目前尚没有商业化的谱库 可供用户检索，其在FAME检测方面的应用还不够广泛。气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)用于 检测FAME具有高的灵敏度、低检测限，并且具有商业化的NIST谱库可供检索，具有良好的应 用前景。 目前，对FAME进行定量的方法主要包括面积归一化法、内标法、外标法等。面积归 一化法是在所有组分的校正因子相同的条件下，将待测样品所有出峰组分的含量按100％ 计，根据响应值计算每个组分的百分含量。这种方法计算简便，并且能消除因仪器状态和运 行条件的差异而带来的误差。但是，该方法不能得到待测组分的绝对含量。内标法直接使用 待测组分和内标(一般为十九烷酸甲酯)的响应值(峰面积或峰高)的比值以及内标的含量 确定待测组分的含量，但是没有考虑不同FAME对仪器的响应存在差异。外标法则是通过建 立标准曲线来计算样品中待测FAME的含量。但是，由于目前市场上销售的FAME混合标准品 不能包含从土壤中所提取的全部目标FAME，该方法不能对土壤所特有的FAME进行准确定 量。 任慧琴等(2014)发表的文章“土壤微生物群落结构分析中磷脂脂肪酸法和温和碱 性甲酯化法的比较及定量优化”(环境化学,33(5):760-764)分别使用“内标对比法”(同时 使用内标和外标)和“直接计算法”(依据样品含量和峰面积呈正比的原理)两种方法对土壤 FAME进行定量，发现两者存在差异，进而通过两者的比值计算出校正系数，并对只能用于 “直接计算法”的组分进行校正，使得没有标准品的FAME仍能定量，优化了利用GC-MS测定 FAME的定量方法。然而，该方法仍然存在以下不足：第一，虽然“内标对比法”考虑了不同 FAME对GC-MS的响应不同，但用于定量的公式默认样品中和内外标混合溶液中内标的质量 相同，限制了公式的应用；第二，外标中没有包含的FAME的校正因子，使用的是已知的所有 4 CN 111551663 A 说　明　书 2/10 页 FAME的校正因子的平均值，平均化处理在某种程度上会使误差增大。因此，有必要进一步优 化土壤脂肪酸甲酯的定量方法。
技术实现要素：
本发明的主要目的在于，克服现有技术中的不足，建立一种测定土壤脂肪酸甲酯 的定量方法及其应用，从而实现对土壤微生物群落结构更准确的表征。 本发明的目的之一是提供一种测定土壤脂肪酸甲酯的定量方法，包括以下步骤： 1)确定GC-MS的运行参数：选用37种脂肪酸甲酯混合标准品作为外标，在GC-MS上 确定仪器运行参数； 2)确定外标中每种脂肪酸甲酯的校正因子：配制含内标十九烷酸甲酯和外标的混 合溶液，通过步骤1)所确定的GC-MS运行参数测定该混合溶液，利用校正因子计算公式计算 外标中每种脂肪酸甲酯的校正因子，校正因子的计算公式为： 其中，fx为外标中脂肪酸甲酯的校正因子，M0为内标的质量(μg)，A0为内标在GC图 谱上的响应值，Ax为该脂肪酸甲酯在GC图谱上的响应值；Mx为该脂肪酸甲酯的质量(μg)； 3)提取土壤中的磷脂脂肪酸并进行甲酯化：采集土壤样本，采用Bligh-Dyer方法 提取土壤中的磷脂脂肪酸，并将提取到的磷脂脂肪酸甲酯化； 4)定性分析样品：在步骤3)所得到的脂肪酸甲酯中加入内标十九烷酸甲酯，采用 步骤1)所确定的GC-MS运行参数对待测脂肪酸甲酯进行测定，并对碳原子数为9-19的待测 脂肪酸甲酯进行类型的定性分析，并确定碳原子数为9-19的待测脂肪酸甲酯的校正因子； 5)定量分析样品：结合步骤4)所确定的土壤中碳原子数为9-19的脂肪酸甲酯的校 正因子及每种脂肪酸甲酯在GC图谱上的响应值计算土壤中碳原子数为9-19的待测脂肪酸 甲酯的浓度(C，nmol.g-1)，计算公式为： 其中，f为待测脂肪酸甲酯的校正因子，Mi为内标的质量(μg)，Ai为内标在GC图谱上 的响应值，A为该脂肪酸甲酯在GC图谱上的响应值；Mmol为该脂肪酸甲酯的分子摩尔质量(μ g.μmol-1)，m为烘干土壤质量(g)。 作为优选，步骤1)中确定GC-MS的运行参数包括以下过程： (1)吸取购买的37种脂肪酸甲酯混合标准品0.08ml，用正己烷将其稀释至2ml，即 稀释25倍，稀释后的浓度范围为6.58-24.9μg.ml-1，然后在GC-MS上进行测定； (2)进行GC分析，选用VF-23ms色谱柱对脂肪酸甲酯进行测定，载气为He气，不分流 进样，进样体积为1μl，进样口温度为260℃；色谱柱箱的升温程序为：初始温度为60℃，保持 1min；5℃.min-1升至170℃，保持2min；2℃.min-1升至200℃，保持5min； (3)进行MS分析，采用全扫描模式，质荷比扫描范围为50-500，电子轰击离子源，电 子能量为70eV，离子源温度为180℃，质谱接口温度为200℃。 作为优选，步骤2)中所述的配制含内标十九烷酸甲酯和外标的混合溶液的具体过 程如下：选用十九烷酸甲酯为内标，称取0.002g内标，使用10ml正己烷配制成浓度为200μ g.ml-1的内标溶液；将0.2ml浓度为200μg.ml-1的内标溶液和0.2ml购买的混合外标溶液混 5 CN 111551663 A 说　明　书 3/10 页 合，用正己烷稀释至5ml，得到内标浓度为8μg.ml-1而混合外标的浓度为6.58-24.9μg.ml-1 的混合溶液。吸取2ml该混合溶液加到样品瓶内进行GC-MS分析。 作为优选，步骤3)中所述的采用Bligh-Dyer方法提取土壤中脂肪酸的具体包括以 下过程： a.提取土壤脂质：称取新鲜土壤，该新鲜土壤烘干后为2.00g，首先用15ml  Bligh- Dyer提取液对新鲜土壤提取，收集提取液，再次使用7ml  Bligh-Dyer提取液进行提取，将2 次提取液合并，静置过夜后，取下层氯仿层，即为提取出的土壤脂质，37℃水浴N2吹干； b.分离磷脂脂肪酸：将步骤a所得到的土壤脂质用氯仿溶出，然后加入到硅胶柱 中，依次使用5ml氯仿、5ml丙酮和5ml甲醇淋洗硅胶柱，收集甲醇淋洗硅胶柱的淋出液，并在 37℃水浴N2吹干，得到磷脂脂肪酸； c.甲酯化反应：在步骤b得到的磷脂脂肪酸中加入1ml体积比为1:1的甲苯-甲醇溶 剂溶解，然后加入1ml浓度为0.2mol.l-1甲醇-KOH溶液，37℃水浴反应30min，最后加入1ml浓 度为1mol.l-1醋酸停止反应，加入2ml氯仿，2ml水，静置过夜使其分层，取有机相，37℃水浴 N2吹干，得到待测脂肪酸甲酯。 步骤a所述的Bligh-Dyer提取液中氯仿、甲醇、磷酸缓冲液的体积比为1:2:0.8。 作为优选，步骤4)中待测脂肪酸甲酯中加入的内标浓度为3.2μg .ml-1，体积为 0.5ml。 作为优选，步骤4)中所述定性分析指结合标准品的保留时间、文献资料查找和 NIST谱库检索，对待测样品中碳原子数为9-19的脂肪酸甲酯的定性分析。 作为优选，步骤4)中所述确定待测样品中碳原子数为9-19的脂肪酸甲酯的校正因 子的方法如下：外标中包含的脂肪酸甲酯采用步骤2)所计算出的校正因子，对于待测样品 中存在而外标中不包含的脂肪酸甲酯的校正因子的确定原则是采用碳原子数、双键和支链 的数量和位置均相同的外标中包含的脂肪酸甲酯的校正因子。 本发明的另一目的还提供了一种如前述所述的测定土壤脂肪酸甲酯的定量方法 的应用。 与现有技术相比，本发明的有益效果是： 本发明综合利用内标和外标，考虑了不同FAME对仪器的响应不同，得出了混合外 标中不包含但土壤中存在的目标FAME的校正因子，更加准确的对FAME进行定量。该发明的 应用不仅优化了利用PLFAs技术对土壤微生物群落结构的表征，也可以用来测定其他样品 的各种碳链长度的FAME。 附图说明 图1为本发明的37种脂肪酸甲酯外标的色谱图； 图2为本发明的技术流程图； 图3为通过利用本发明对FAME定量而得出的土壤微生物各类群比例。