技术摘要：
本发明公开了Axenfeld‑Rieger综合征致病基因缺失移码突变检测试剂盒及其应用。所述的基因突变是首次发现的与Axenfeld‑Rieger综合征密切相关的PITX2基因突变c.525delC，即PITX2基因的第3外显子的第525位发生碱基C的缺失，该突变导致编码第175位天冬氨酸遗传密码子(GAC 全部
背景技术：
Axenfeld-Rieger综合征是一组罕见的眼相关遗传病，为常染色体显性遗传，外显 率接近100％，主要特征表现为角膜后胚胎环(即Schwalbe线增厚突出和前移)、虹膜异常、 瞳孔偏位或多瞳孔，根据眼部受累部位不同可分为Axenfeld异常和Rieger异常，也可伴有 综合征性全身发育缺陷如颌骨发育不全、牙缺失或小牙、听力下降、脐部皮肤突出等，个别 患者出现心脑发育异常。约有50％的患者伴发青光眼且多于青少年时期发病。因此该病为 患者本人及家庭带来沉重负担。 Axenfeld-Rieger综合征涉及全身多个系统，且具有表型异质性，临床上诊断较为 困难，因此明确的基因诊断可为临床诊断进行指导。PITX2基因和FOCX1基因为其主要的致 病突变基因，因此进行致病基因检测，不仅可为患者本人提供明确的基因诊断，也有助于尚 未得到诊断的患者家属早期发现疾病、早期治疗，且可用于产前诊断及遗传咨询。 目前发现与Axenfeld-Rieger综合征相关的PITX2基因突变多为单个碱基位点的 替换，而对于蛋白质功能影响更大的碱基缺失/插入移码突变少有报道。本案涉及的 c.5256delC致病突变，首次在中国Axenfeld-Rieger综合征患者中发现，本案发明人曾在专 利号为ZL201410057930.0的专利申请中提出另一中国患者家系携带的PITX2基因碱基缺失 突变c.77delA突变，但该专利所述检测试剂盒无法检出本发明涉及的c.525delC突变。因此 需要新方法进行c.525delC突变筛查，以提高PITX2基因缺失移码突变检出率、丰富PITX2基 因缺失移码突变的检测手段。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种用于Axenfeld-Rieger综合征缺失移码突变检测试剂 盒，弥补了现有Axenfeld-Rieger综合征致病基因检测技术中的不足，以我国新发现的 PITX2基因缺失移码突变：c.525delC为基础，提供一种迅速检测Axenfeld-Rieger综合征的 方法。该PITX2基因gDNA的NCBI参考序列号为NC_000004，mRNA的NCBI参考序列号为NM_ 000325.6，所对应的蛋白质NCBI参考序列号为NP_000316.2。 本发明的目的是通过以下技术方案实现的： 本发明的一种Axenfeld-Rieger综合征致病基因缺失移码突变检测的试剂盒， 25mM dNTPs，10×PCR反应缓冲液，DNA聚合酶，PCR扩增引物对和ddH2O，其特征在 于，所述的PCR扩增引物对由引物1和引物2组成，其中引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所 示，引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述的Axenfeld-Rieger综合征致病基因是突 3 CN 111718989 A 说 明 书 2/4 页 变的PITX2基因，mRNA的NCBI参考序列号为NM_000325.6，以cDNA第一个核苷酸作为1计算， 该突变为PITX2基因第3外显子的第525位碱基C缺失。 其中，突变前PITX2基因的第3外显子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，突变后 PITX2基因的第3外显子的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；突变前PITX2蛋白氨基酸序列如 SEQ ID NO:5所示，突变后PITX2蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。 该突变导致编码第175位天冬氨酸的遗传密码子(GAC)变成谷氨酸的遗传密码子 (GAG)，并由此开始发生移码突变，导致蛋白提前终止，即发生p.Asp175Glufs*33移码突变。 其中，优选的，所述试剂盒利用PCR技术进行Axenfeld-Rieger综合征致病基因的 扩增，反应程序为： 98℃预变性2分钟，然后进入第一个循环：98℃变性10秒、60℃退火复性15秒、72℃ 延伸15秒，共进行40个循环，72℃1min，4℃保存。 进一步的，本发明还提出了所述的试剂盒在制备Axenfeld-Rieger综合征致病基 因缺失移码突变检测试剂中应用。 相较于现有技术，本发明的有益效果是： 本发明利用新发现的我国PITX2基因c.525delC缺失移码突变及所提供的特异性 检测引物可对Axenfeld-Rieger综合征致病突变做出快速检测并提供基因诊断。本发明操 作简单，成本低，结果直接、准确，适合临床应用，并可为疾病的分子机制研究奠定基础。 附图说明 图1为正常人的正向测序图； 图2为Axenfeld-Rieger综合征患者的正向测序图； 图3为Axenfeld-Rieger综合征患者的反向测序图。
本发明公开了Axenfeld‑Rieger综合征致病基因缺失移码突变检测试剂盒及其应用。所述的基因突变是首次发现的与Axenfeld‑Rieger综合征密切相关的PITX2基因突变c.525delC，即PITX2基因的第3外显子的第525位发生碱基C的缺失，该突变导致编码第175位天冬氨酸遗传密码子(GAC 全部
背景技术：
Axenfeld-Rieger综合征是一组罕见的眼相关遗传病，为常染色体显性遗传，外显 率接近100％，主要特征表现为角膜后胚胎环(即Schwalbe线增厚突出和前移)、虹膜异常、 瞳孔偏位或多瞳孔，根据眼部受累部位不同可分为Axenfeld异常和Rieger异常，也可伴有 综合征性全身发育缺陷如颌骨发育不全、牙缺失或小牙、听力下降、脐部皮肤突出等，个别 患者出现心脑发育异常。约有50％的患者伴发青光眼且多于青少年时期发病。因此该病为 患者本人及家庭带来沉重负担。 Axenfeld-Rieger综合征涉及全身多个系统，且具有表型异质性，临床上诊断较为 困难，因此明确的基因诊断可为临床诊断进行指导。PITX2基因和FOCX1基因为其主要的致 病突变基因，因此进行致病基因检测，不仅可为患者本人提供明确的基因诊断，也有助于尚 未得到诊断的患者家属早期发现疾病、早期治疗，且可用于产前诊断及遗传咨询。 目前发现与Axenfeld-Rieger综合征相关的PITX2基因突变多为单个碱基位点的 替换，而对于蛋白质功能影响更大的碱基缺失/插入移码突变少有报道。本案涉及的 c.5256delC致病突变，首次在中国Axenfeld-Rieger综合征患者中发现，本案发明人曾在专 利号为ZL201410057930.0的专利申请中提出另一中国患者家系携带的PITX2基因碱基缺失 突变c.77delA突变，但该专利所述检测试剂盒无法检出本发明涉及的c.525delC突变。因此 需要新方法进行c.525delC突变筛查，以提高PITX2基因缺失移码突变检出率、丰富PITX2基 因缺失移码突变的检测手段。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种用于Axenfeld-Rieger综合征缺失移码突变检测试剂 盒，弥补了现有Axenfeld-Rieger综合征致病基因检测技术中的不足，以我国新发现的 PITX2基因缺失移码突变：c.525delC为基础，提供一种迅速检测Axenfeld-Rieger综合征的 方法。该PITX2基因gDNA的NCBI参考序列号为NC_000004，mRNA的NCBI参考序列号为NM_ 000325.6，所对应的蛋白质NCBI参考序列号为NP_000316.2。 本发明的目的是通过以下技术方案实现的： 本发明的一种Axenfeld-Rieger综合征致病基因缺失移码突变检测的试剂盒， 25mM dNTPs，10×PCR反应缓冲液，DNA聚合酶，PCR扩增引物对和ddH2O，其特征在 于，所述的PCR扩增引物对由引物1和引物2组成，其中引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所 示，引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述的Axenfeld-Rieger综合征致病基因是突 3 CN 111718989 A 说 明 书 2/4 页 变的PITX2基因，mRNA的NCBI参考序列号为NM_000325.6，以cDNA第一个核苷酸作为1计算， 该突变为PITX2基因第3外显子的第525位碱基C缺失。 其中，突变前PITX2基因的第3外显子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，突变后 PITX2基因的第3外显子的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；突变前PITX2蛋白氨基酸序列如 SEQ ID NO:5所示，突变后PITX2蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。 该突变导致编码第175位天冬氨酸的遗传密码子(GAC)变成谷氨酸的遗传密码子 (GAG)，并由此开始发生移码突变，导致蛋白提前终止，即发生p.Asp175Glufs*33移码突变。 其中，优选的，所述试剂盒利用PCR技术进行Axenfeld-Rieger综合征致病基因的 扩增，反应程序为： 98℃预变性2分钟，然后进入第一个循环：98℃变性10秒、60℃退火复性15秒、72℃ 延伸15秒，共进行40个循环，72℃1min，4℃保存。 进一步的，本发明还提出了所述的试剂盒在制备Axenfeld-Rieger综合征致病基 因缺失移码突变检测试剂中应用。 相较于现有技术，本发明的有益效果是： 本发明利用新发现的我国PITX2基因c.525delC缺失移码突变及所提供的特异性 检测引物可对Axenfeld-Rieger综合征致病突变做出快速检测并提供基因诊断。本发明操 作简单，成本低，结果直接、准确，适合临床应用，并可为疾病的分子机制研究奠定基础。 附图说明 图1为正常人的正向测序图； 图2为Axenfeld-Rieger综合征患者的正向测序图； 图3为Axenfeld-Rieger综合征患者的反向测序图。
