技术摘要：
本发明系关于一种组合物用于制备治疗癌细胞的药物的用途，该组合物包含罗丹明或罗丹明衍生物，以及一肽包含SEQ ID NO：1的序列，其中该罗丹明或该罗丹明衍生物与该肽复合。
背景技术：
口腔癌的现状和治疗方法 口腔癌是全世界10种最常见的癌症之一，估计每年诊断的新病例超过  500 ,000 例。大约95％的口腔癌是口腔鳞状细胞癌(oral  squamous  cell  carcinoma，OSCC)，并且可 以发生在口腔的任何地方，包括舌头、嘴唇、牙龈、颊粘膜和上颚。它还可以局部扩散到口周 结构或转移到区域和远程淋巴结。 口腔癌是世界上十种最常见的癌症之一。临床检测的延误、预后不良以及缺乏特 定的生物标志物限制了有效治疗的选项以及昂贵治疗的替代方案。迄今为止，口腔癌的治 疗选择有限。OSCC的主要治疗策略是手术、放射疗法和化学疗法包括多西紫杉醇 (docetaxel)、5-氟尿嘧啶  (5-fluorouracil)、顺铂(cisplatin)或是可同时与一种被批准 作为另一种新的治疗选择的靶向治疗的西妥昔单株抗体(cetuximab)结合使用。然而，治疗 副作用、毁容和疼痛的恐惧是实施治疗的主要临床障碍。目前的研究主要集中在口腔癌新 疗法的发现和开发，此为控制不断上升的口腔癌相关死亡率所必需的。口腔癌的靶向治疗 仍然是一个相对较新的概念，因此需要更多的研究来证实这些药物用于化疗的临床效果。 光照治疗采用紫外线或可见光，使用或不使用光敏剂——一种能够吸收光能并将能量传递 给相邻分子的分子((Gambichler,T.,Breuckmann,F.,Boms,S.,Altmeyer,P.,和  Kreuter, A .(2005) .Narrowband  UVB  phototherapy  in  skin  conditions  beyond  psoriasis.Journal  of  the  American  Academy  of  Dermatology  52,660-670；Paus,  S., Schmitz-Hubsch ,T .,Wullner ,U .,Vogel ,A .,Klockgether ,T .,and  Abele ,M .  (2007) .Bright  light  therapy  in  Parkinson 's  disease:a  pilot  study .Movement  disorders:official  journal  of  the  Movement  Disorder  Society  22 ,1495-1498；  Srinivasan ,D .,Muthukrishnan ,N .,Johnson ,G .A .,Erazo-Oliveras ,A .,Lim ,J .,  Simanek ,E .E .,and  Pellois ,J .P .(2011) .Conjugation  to  the  cell-penetrating  peptide  TAT  potentiates  the  photodynamic  effect  of  carboxytetramethylrhodami ne.PloS  one  6,e17732)。其临床上用于治疗包括头颈部、肺部、膀胱和特殊皮肤的恶性癌 症。尽管光照治疗所产生的副作用相对较少，但对于特别是口腔癌等鳞状细胞癌的光疗药 物是有限的。这进一步指出对于开发早期诊断和早期治疗方法的重要性。硫酸乙酰肝素  (Heparan  sulfate  proteoglycans，HSPGs)蛋白多糖。 硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)是具有一个或多个共价连接的硫酸乙酰肝素 (h e p a r a n  s u l f a t e ，H S) 链的糖蛋白 ，其中硫酸乙酰肝素是一种糖胺聚糖 (glycosaminoglycan，GAG)。HSPG存在于细胞表面或细胞外基质中，在那里它们与多种的配 3 CN 111588858 A 说　明　书 2/14 页 体相互作用。最近显现出HSPG作为细胞表面上一多种大分子蛋白、肽的受体。外吐小体 (Exosomes)、细胞穿透肽(cell  penetrating  peptides)、多价阳离子—核酸复合物 (polycation–nucleic  acid  complexes)、病毒(viruses)、脂蛋白(lipoproteins)、生长因 子(growth  factors)  和形态发生素(morphogens)以及其他配体(ligands)透过HSPG介导 经内吞作用进入细胞。HSPG可根据其次细胞位置的分布区分为三类：膜蛋白型态HSPG，如多 配体蛋白聚糖(syndecans)和磷脂酰肌醇蛋白聚糖  (glypicans)；分泌的细胞外基质型态 HSPG，如：第十八型胶原蛋白(type  XVIII  collagen)和珍珠素(perlecan)；和分泌小泡蛋 白多糖(serglycin)。此外，HSPG可以结合于生长因子、趋化因子、细胞因子和形态发生素， 保护它们免于蛋白质裂解作用。这些相互作用提供一系列调节因子的储存，可透过选择性 降解HS链释放调节因子。过去的研究还报导了细胞表面  HSPG促进FGF2-FGF受体复合物的 形成和信号传导。 GAG结合肽(GBP) GAG结合肽是衍生自嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(eosinophil  cationic  protein， ECP)的肽，其由嗜酸性粒细胞所分泌。嗜酸性粒细胞是一种颗粒状血细胞，其为一种与炎症 过程如寄生虫感染、哮喘和过敏性疾病有关的多功能白细胞。为了反应各种不同的刺激，嗜 酸性粒细胞被募集到炎性区域并分泌颗粒蛋白，包括主要碱性蛋白(major  basic  proteins，MBP)、嗜酸性粒细胞过氧化物酶(eosinophil  peroxidase，EPO)、嗜酸性粒细胞 阳离子蛋白(eosinophil  cationic  protein，ECP)、嗜酸性粒细胞衍生的神经毒素  (eosinophil-derived  neurotoxin，EDN)和脂质介质。ECP被分类为人类  RNase3，由活化的 嗜酸性粒细胞释放以促进消除入侵的微生物。除了消除入侵的微生物外，ECP还具有多种功 能性，如：核糖核酸、细胞毒性、抗病毒和乙酰肝素结合的活性。 ECP和乙酰肝素之间的分子相互作用已经被描述且鉴定出其中ECP的乙酰肝素结 合基序(Fan,T.C.,Chang,H.T.,Chen,I.W.,Wang,H.Y.,and  Chang,M.D.(2007) .A  heparan  sulfate-facilitated  and  raft-dependent  macropinocytosis  of  eosinophil  cationic  protein.Traffic  8,1778-1795)。一ECP 的特定序列，34RWRCK38，已被鉴定为乙 酰肝素结合区域(heparan-binding  motif)(Fan,T.C.,Fang,S.L.,Hwang,C.S.,Hsu,C.Y., Lu ,X .A .,Hung ,S .C .,  Lin ,S .C .,and  Chang ,M .D .(2008) .Characterization  of  molecular  interactions  between  eosinophil  cationic  protein  and  heparin.The  Journal  of  biological  chemistry  283 ,25468-25474)。具体地，10残基肽 34NYRWRCKNQN41被鉴定为源自ECP的肝素结合基序的细胞穿透肽(在以下段落中以GBP表 示)。GBP已经被证明具有硫酸乙酰肝素结合和细胞穿透活性(Fan ,T .C .,  Fang ,S .L ., Hwang ,C .S .,Hsu ,C .Y .,Lu ,X .A .,Hung ,S .C .,Lin ,S .C .,and  Chang ,  M .D .(2008) .Characterization  of  molecular  interactions  between  eosinophil  cationic  protein  and  heparin.The  Journal  of  biological  chemistry  283,  25468-25474)； Fang ,S .L .,Fan ,T .C .,Fu ,H .W .,Chen ,C .J .,Hwang ,C .S .,Hung ,  T .J .,Lin ,L .Y .,and  Chang ,M .D .(2013) .A  novel  cell-penetrating  peptide  derived  from  human  eosinophil  cationic  protein.PloS  one  8,e57318)。值得注意的是，GBP能够将小荧光分 子、重组蛋白、纳米颗粒和拟肽药物递送到细胞中(Fang ,S.L.,Fan,T.C.,Fu,H.W.,Chen, C .J .,Hwang ,C .S .,Hung ,T .J .,  Lin ,L .Y .,and  Chang ,M .D .(2013) .A  novel  cell- 4 CN 111588858 A 说　明　书 3/14 页 penetrating  peptide  derived  from  human  eosinophil  cationic  protein.PloS  one  8,e57318)。综合上述，GBP  对于药物输送上具有突出的临床意义。 罗丹明(Rhodamine)和罗丹明衍生物 罗丹明是一个具有相关联的化学化合物和荧光染剂的家族。它们通常用作示踪剂 来观察流动和运输的速率和方向。罗丹明染料通常是有毒的并且可溶于水、甲醇和乙醇。有 许多罗丹明衍生物用于成像目的，包括羧基四甲基罗丹明 (Carboxytetramethylrhodamine，TAMRA)、四甲基罗丹明  (Tetramethylrhodamine，TMR)及 其异硫氰酸酯衍生物(isothiocyanate  derivative，TRITC)。TMR是罗丹明衍生物之一，已 广泛用于蛋白质标记、寡核苷酸标记和DNA测序等领域。过去的研究报导罗丹明123是一种 线粒体特异性荧光染料，已应用于特异性地定位活细胞中的线粒体(Johnson ,  L .V ., Walsh,M.L.,and  Chen,L.B.(1980) .Localization  of  mitochondria  in  living  cells  with  rhodamine  123 .Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America  77,990-994)。 细胞死亡的机制 细胞凋亡(Apoptosis)是细胞自杀程序演化上保留的生物学过程，其为多细胞生 物的正常发育和体内平衡所必需，并且也涉及在许多病理的过程中。细胞凋亡的特征在于 细胞显著的形态变化，例如细胞膜突起  (membrane  blebbing)、DNA降解、核碎裂(nuclear  fragmentation)、染色质浓缩和一些细胞蛋白的切割，例如：聚(ADP-核糖)聚合酶(Poly  (ADP-ribose)polymerase，PARP)。细胞凋亡通常由两种不同的信号传导途径诱导，包括线 粒体途径(mitochondrial  pathway)和死亡受体(death  receptor  pathway)途径。线粒体 途径通常涉及线粒体细胞色素c(cytochrome  c)释放到细胞质中。此外，已知Bcl-2蛋白家 族成员在控制线粒体释放细胞色素c  中扮演重要的角色。在凋亡信号后，Bax、Bak或Bid等 促凋亡Bcl-2蛋白成员会被活化。相反的，Bcl-2和Bcl-XL在内的抗凋亡成员可以防止上述 现象发生。 PARP参与许多如DNA修复、基因体稳定性和细胞程序性凋亡等细胞过程的蛋白质 家族。细胞凋亡过程中，PARP被凋亡蛋白酶(caspase)选择性切割而变得不能对DNA损伤做 出反应。通常认为PARP裂解是由凋亡蛋白酶-3(caspase-3)催化的，但凋亡蛋白酶-7 (caspase-7)对PARP的裂解亦曾被报导。尽管PARP是凋亡蛋白酶的潜在标靶分子之一，但是 切割被认为是凋亡蛋白酶活化的证据，并且已被广泛用作细胞凋亡的标志。尽管如此，近年 来的研究显示PARP切割亦可在缺乏凋亡蛋白酶原-3  (procaspase-3)或-7切割情况下进 行，因此可以不依赖于凋亡蛋白酶-3或  -7的活化。许多先前的研究已经显示线粒体途径导 致的细胞凋亡涉及凋亡蛋白酶非依赖性凋亡信号传导，并导致肿瘤细胞的替代性杀伤。 (Canitano ,  A.,Iessi ,E .,Spugnini ,E .P.,Federici ,C .,and  Fais ,S.(2016) .Proton  pump  inhibitors  induce  a  caspase-independent  antitumor  effect  against  human  multiple  myeloma.Cancer  letters  376,278-283；Kurita,M.,Hanada,S.,  Ichimaru,Y., Saito ,H .,Tabata ,K .,Asami ,S.,Miyairi ,S.,and  Suzuki ,T .(2016) .  Indirubin  3 '- E p o x i d e  I n d u c e s  C a s p a s e - I n d e p e n d e n t  C e l l  D e a t h  i n  H u m a n  Neuroblastoma.Biological&pharmaceutical  bulletin  39,993-999；Ogura,T.,  Tanaka, Y.,Tamaki ,H.,and  Harada ,M.(2016) .Docetaxel  induces  Bcl-2-and  pro-apoptotic  5 CN 111588858 A 说　明　书 4/14 页 caspase-independent  death  of  human  prostate  cancer  DU145  cells.  International  journal  of  oncology  48,2330-2338；Sarosiek,K.A.,and  Letai,A.  (2016) .Directly  targeting  the  mitochondrial  pathway  of  apoptosis  for  cancer  therapy  using  BH3  mimetics-recent  successes ,current  challenges  and  future  promise .The  FEBS  journal  283,3523-3533)。除细胞色素-c(cytochrome-c) 的释放外，线粒体外膜通透性增 加导致各种蛋白质释放造成了其他胞器的损伤。基于这些证据，进一步了解凋亡蛋白酶非 依赖性的细胞凋亡的作用能提供开发有效癌症疗法的新机会。 癌症中的活性氧化物质(Reactive  oxygen  species，ROS) ROS是含氧的化学反应性化学物质，例如过氧化物、超氧化物、羟基和单线态氧。在 生物学背景下，ROS形成为氧的正常代谢的天然副产物，并且在细胞信号传导和体内平衡中 具有重要作用。然而，在环境压力(例如，UV或热暴露)期间，ROS浓度可显著增加。在几乎所 有癌症中都检测到ROS的升高，其中它们促进肿瘤发展和进展的许多方面。代谢活性增加、 过氧化物酶体活性、线粒体功能障碍、氧化酶活性增加或通过与浸润性免疫细胞的串扰引 起癌细胞中的ROS浓度上升。临床上，ROS产生是所有非手术治疗癌症的方法所共有的机制， 包括放射疗法、化学疗法和光动力疗法，因为它们涉及引发细胞死亡，因此ROS也用于杀死 癌细胞。无数研究证明，癌细胞中ROS的持续或组成性产生与凋亡细胞死亡呈负相关。增加 的ROS产生或降低的ROS清除能力在细胞生理学中起关键作用。过量的细胞ROS量会对各种 细胞造成氧化损伤，导致细胞凋亡和细胞死亡。因此，一些癌细胞对由产生细胞内ROS水平 的外源性ROS产生化合物诱导的氧化应激更敏感。迄今为止，许多靶向ROS积累的天然药物 引起了人们的极大兴趣并导致了临床试验和治疗。 N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC) NAC是氨基酸L-半胱氨酸的乙酰化变体，并且广泛用于对乙酰氨基酚过量的特异 性解毒剂。NAC作为一种安全且廉价的营养补充剂或药物，从很久以前就可以商业化获取。 NAC直接作为自由基的清除剂，特别是氧自由基。它还被推荐作为由产生游离氧自由基引起 的不同疾病的潜在治疗选择。因此，NAC被认为是一种重要的抗氧化剂。丰富的谷胱甘肽 (Glutathione，  GSH)其作为ROS清除酶的受质的作用在调节细胞凋亡中扮演重要角色。因 此，NAC已被广泛用作细胞凋亡研究领域的研究工具，用于研究ROS  在诱导细胞凋亡中的作 用。 此外，NAC是良好耐受的溶解药物，其缓和粘附粘液分泌物并增强谷胱甘肽S-转移 酶(glutathione  S-transferase)活性。迄今为止，NAC已应用于治疗多种疾病，如肝癌、多 囊胞性卵巢症候群、慢性支气管炎、哮喘、阿兹海默症、帕金森氏症等。作为一种药物，NAC可 能是理想的外源物，能够通过其自身的新陈代谢直接进入内源性生化过程。对NAC的作用了 解得越多，临床应用也就越来越广泛。NAC现在被广泛用作粘液溶解剂和治疗人类免疫缺陷 病毒HIV，且已经报导其用于慢性阻塞性肺病和由造影剂引起的肾病的功效。
技术实现要素：
本发明旨在探索特异性四甲基罗丹明(tetramethylrhodamine，TMR)  –复合GAG结 合肽(TMR-GBP，其在摘要中以TMR-GBP表示)在调节癌细胞移动性中的作用。 本发明公开了TMR-GBP在特定细胞株中诱导的细胞毒性。为了理解由TMR-GBP诱导 6 CN 111588858 A 说　明　书 5/14 页 的细胞毒性的性质，用肽或复合有不同化学物质的肽处理细胞，其中TMR-GBP及其类似物对 特定细胞株诱导了显著的细胞毒性作用。值得注意的是，发现TMR-GBP在不存在凋亡蛋白酶 活性的情况下诱导PARP裂解。此外，在TMR-GBP处置下检测到线粒体碎裂和细胞色素c释放。 并发现TMR-GBP诱导的细胞毒性不依赖于钙释放。反之，用抗氧化剂处理后，TMR-GBP诱导的 细胞毒性减弱。总之，TMR-GBP诱导了不依赖于凋亡蛋白酶的细胞死亡，其由线粒体碎裂，细 胞色素c释放，  PARP裂解介导，并最终导致特定细胞株中的细胞凋亡。 在本发明中，发现TMR-GBP处理诱导了细胞内ROS的产生。由于线粒体呼吸链功能 异常而导致ROS累积。因此，根据所呈现的免疫荧光染色的数据，在TMR-GBP处置下检测到线 粒体碎裂和细胞色素c释放。此外，细胞色素-c从线粒体中释放是细胞凋亡过程中的主要现 象。亦发现细胞色素-c诱导染色质凝聚。在本发明中，还检测到TMR-GBP诱导DNA损伤和  PRRP切割，导致口腔癌细胞凋亡。 在本发明中，TMR-GBP抑制不同口腔癌细胞的细胞活性。有趣的是，细胞活性在乳 腺癌、胚胎肾、子宫颈癌，肝癌和肺癌中没有显著影响。此外，本发明中使用的大多数口腔癌 细胞是鳞状细胞癌，其他类型是上皮来源的。因此，GBP介导的细胞毒性限制于鳞状细胞癌。 在本发明中，发现TMR-GBP诱导的细胞毒性被NAC部分抑制。在本发明中，NAC处理 可逆转因TMR-GBP导致的DNA损伤和ROS产生。因此，NAC可以促进受TMR-GBP影响之口腔癌细 胞的细胞活性。值得注意的是，NAC的临床应用目前已被扩展，有些人也使用NAC作为膳食补 充剂。然而，根据本发明，不推荐口腔癌患者在TMR-GBP或化疗药物治疗同时摄入任何含有 NAC的补充剂，这些补充剂会抑制TMR-GBP的细胞毒性。 在本发明中，意外发现了TMR-GBP对口腔癌细胞特异性地细胞毒性作用。由于化学 疗法和放射疗法具有许多副作用和不便，因此TMR-GBP  可被认为适用于开发软膏以方便患 者。此外，根据本发明，发现TMR-GBP  诱导的细胞毒性是光敏感的。因此，可以通过光刺激来 改善治疗。 因此，本发明涉及一种组合物用于制备治疗癌细胞的药物的用途，该组合物包含： 一罗丹明或罗丹明衍生物，以及一包含序列SEQ  ID  NO：1 的肽，其中该罗丹明或罗丹明衍 生物与该肽复合。 于一实施例中，SEQ  ID  NO：1于位置4的Xaa代表Trp或Arg。例如，肽变体可包含SEQ  ID  NO：2或SEQ  ID  NO：3。 SEQ  ID  NO：2由以下序列表示： Asn  Tyr  Arg  Trp  Arg  Cys  Lys  Asn  Gln  Asn SEQ  ID  NO：3由以下序列表示： Asn  Tyr  Arg  Arg  Arg  Cys  Lys  Asn  Gln  Asn 于一实施例中，该癌细胞是上皮细胞癌细胞。于另一实施例中，该上皮细胞癌细胞 是鳞状细胞癌细胞。 于一实施例中，该癌细胞系源自上呼吸消化道的细胞。 于一实施例中，该组合物诱导癌细胞的凋亡。在另一实施例中，该凋亡与凋亡蛋白 酶活化无关。 于一实施例中，该组合物诱导癌细胞的线粒体碎裂。 于一实施例中，该组合物诱导癌细胞的ROS产生。 7 CN 111588858 A 说　明　书 6/14 页 于一实施例中，该组合物诱导癌细胞的DNA损伤。 于一实施例中，该组合物系为光所活化。 于一实施例中，该光的波长为380nm至750nm。 于一实施例中，该光的波长为400nm至620nm。 于一实施例中，该光的波长为470nm至580nm。 本发明亦涉及一种治疗癌细胞的方法，包括：将一包含有一罗丹明或罗丹明衍生 物复合至一包含有一胺基酸序列SEQ  ID  NO：1之肽之组合物施用于有需求之个体，并以光 活化该组合物。 于一实施例中，SEQ  ID  NO：1于位置4的Xaa代表Trp或Arg。例如，肽变体可包含SEQ  ID  NO：2或SEQ  ID  NO：3。 SEQ  ID  NO：2由以下序列表示： Asn  Tyr  Arg  Trp  Arg  Cys  Lys  Asn  Gln  Asn SEQ  ID  NO：3由以下序列表示： Asn  Tyr  Arg  Arg  Arg  Cys  Lys  Asn  Gln  Asn 于一实施例中，该组合物系施用至一团癌细胞中。 于一实施例中，该组合物系透过肠内施用来施用。 于一实施例中，该组合物系透过输注至一团癌细胞中来施用。 于一实施例中，该组合物系透过注射至一团癌细胞中来施用。 于一实施例中，该组合物系施用到切除腔或瘢痕中。 于一实施例中，该癌细胞是上皮细胞癌细胞。于另一实施例中，该上皮细胞癌细胞 是鳞状细胞癌细胞。 于一实施例中，该癌细胞系源自上呼吸消化道的细胞。 于一实施例中，该组合物诱导癌细胞的凋亡。在另一实施例中，该凋亡与凋亡蛋白 酶活化无关。 于一实施例中，该组合物诱导癌细胞的线粒体碎裂。 于一实施例中，该组合物诱导癌细胞的ROS产生。 于一实施例中，该组合物诱导癌细胞的DNA损伤。 于一实施例中，该光的波长为380nm至750nm。 于一实施例中，该光的波长为400nm至620nm。 于一实施例中，该光的波长为470nm至580nm。 如本文中所使用，术语“癌症”意指以最广泛的含义解释，并且包括实质和非实质 恶性肿瘤，癌前病变以及由于其位置而为恶性的肿瘤。 如本文中所使用，术语“鳞状细胞癌”包括但不限于头颈鳞状细胞癌  (head  and  neck  squamous  cell  carcinoma)、鳞状细胞甲状腺癌(squamous  cell  thyroid  carcinoma)、食道癌(esophageal  cancer)、肺鳞状细胞癌  (squamous  cell  carcinoma  of  the  lung)、阴茎鳞状细胞癌(squamous  cell  carcinoma  of  the  penis)如波文氏症 (Bowen’s  disease)、奎瑞氏红皮增生症  (Erythoroplasia  of  Quetrat)，以及波文样丘疹 病(Bowenoid  papulosis)，前列腺鳞状细胞癌(squamous  cell  carcinoma  of  the  prostate)、阴道鳞状细胞癌  (vagina  squamous  cell  carcinoma)和膀胱癌(bladder  8 CN 111588858 A 说　明　书 7/14 页 cancer)。 如本文所使用，术语“受试者”是指可以施用于本发明之医药组合物并且其中可以 发生癌症或增殖性病症的任何活生物体。该术语包括但不限于人类、非人类动物、例如非人 类灵长类动物例如黑猩猩和其他类人猿以及猴子；农场动物如牛、羊、猪、山羊以及马、宠物 如狗以及猫、实验动物包括啮齿动物如小鼠、大鼠和天竺鼠等。该术语不表示特定年龄或性 别。因此，旨在涵盖成人和新生儿以及胎儿，无论是男性或是女性。术语“受试者”还包括易 受条件或疾病状态影响的生物体，如本说明书中通常公开的，但不限于此。受试者的实例包 括人、狗、猫、牛、山羊和小鼠，包括基因转殖物种。术语“非人动物”和“非人类哺乳动物”在 本文中可互换使用，包括所有脊椎动物，例如哺乳动物，例如非-人类灵长类动物(特别是高 等灵长类动物)、绵羊、狗、啮齿动物(例如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛和非哺乳 动物，如鸡、两栖动物、爬行动物等。于实施例中，受试者是人。于另一实施例中，受试者是实 验动物或动物替代品作为疾病模型。 如本文所用，所述腔包括但不限于任何鼻腔肿瘤切除术、鼻窦肿瘤切除术、口腔肿 瘤切除术、唾液腺肿瘤切除术、咽部肿瘤切除术、喉部肿瘤切除术和瘢痕腔黑色素瘤切除 术。切除后的蟹足肿疤痕床可用本发明的组合物治疗，以避免在已知有此类反应风险的人 群中形成蟹足肿或肥厚疤。 本发明的组合物可以以固体、溶液、乳剂、分散体、微胶粒、脂质体，以及其他如含 有本发明中的一种或多种成分作为活性成分的组合物产物，或与有机或无机载体或赋形剂 混合以适用于肠内或肠胃外的施用。活性成分可以被混合，例如，药学上可接受的通常无毒 性的载具如片剂、丸剂、胶囊、栓剂、溶液、乳液、悬浮液以及其他任何合适的形式以供使用。 可使用的载体包括葡萄糖、乳糖、阿拉伯树胶、明胶、甘露醇、淀粉糊、三硅酸镁、滑石、玉米 淀粉、角蛋白、胶体二氧化硅、马铃薯淀粉、尿素、中等链长的甘油三酯、葡聚糖、以及合适用 于制备制剂、固体、半固体或液体形式的其他载体。另外，亦可以使用稳定剂，增稠剂和着色 剂和香料作为辅助。 本发明之组合物可以口服的形式，例如作为片剂、锭剂、锭剂、水性或油性悬浮液、 可分散粉末或颗粒、乳剂、硬或软胶囊或糖浆或酏剂。口服使用的组合物可根据各种已知的 医药组合物制备方法加以制备，而此组合物可含有一种或多种如蔗糖、乳糖或糖精等甜味 剂，如薄荷、冬青油或樱桃等调味剂、着色剂和防腐剂以提供制药上的美观和口感。混合有 活性成分与药学上可接受无毒赋形剂的片剂也可藉由已知方法加以制造。可使用的赋形剂 如：(1)惰性稀释剂，如碳酸钙，乳糖，磷酸钙或磷酸钠；(2)  成粒剂和崩解剂，如玉米淀粉、 马铃薯淀粉或海藻酸；(3)粘合剂，如黄蓍胶、玉米淀粉、明胶或阿拉伯胶，和(4)润滑剂，如 硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可为未包衣，或可以藉由已知技术进行包衣以延迟胃肠道中 的崩解与吸收，从而提供较长时间的持续作用。例如延时材料如单硬脂酸甘油酯或二硬脂 酸甘油酯均可采用，亦可藉由如美国专利案号4256108；  4160452；及4,265,874所描述的技 术包衣，以生成控制药效释放的渗透性治疗片剂。 在某些情况下，口服使用的组合物可为硬明胶胶囊的形式，其中活性成分与惰性 固体稀释剂混合，例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土。它们也可为软明胶胶囊的形式，其中活性 成分与水或油介质混合，例如花生油、液体石蜡或橄榄油。 本发明的组合物可以以适于推注或连续输注的形式存在。用于注射的制剂可以以 9 CN 111588858 A 说　明　书 8/14 页 单位剂量形式提供，例如在注射器、安瓿或多剂量容器中，加入防腐剂。该组合物可以采取 诸如油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制剂，例如悬浮剂、 稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是粉末形式，使用前用合适的载体，例如无菌无热 原水，重构。 附图说明 图1：与罗丹明和TMR的复合诱导GBP细胞毒性。为了研究不同GBP  对口腔癌的影 响，以50μM  GBP处理Ca922细胞48小时，并透过WST-8测定测量细胞活性 图2：TMR-GBP诱导细胞毒性是光敏感的。将Ca922细胞在35mm培养皿上培养过夜， 然后分别用1％DMSO，12.5μM  TMR、GBP、TMR-GBP  处理，并透过旷时活细胞显微镜(time- lapse  live  cell  microscope)监测。将细胞暴露于指示波长每4小时一次，每次持续100毫 秒并持续至20小时。使用10X放大率下的显微镜撷取图像并对每个实验组的五个不同视野 中的图像计数至少300个细胞。死亡率系透过计算整个群体中死细胞的百分比来评估。三个 独立实验的标准偏差以条状表示。 图3：TMR-GBP诱导细胞毒性是具细胞类型特异性。将指示的细胞接种在96孔盘中， 以TMR-GBP处理48小时，然后进行WST-8测定。指示细胞的存活率百分比如所示。 图4：TMR-GBP诱导口腔癌细胞死亡。选择代表性的微分干涉相差图像以显示用 TMR-GBP处理的细胞的形态。时间戳指示了00:00表示“时：分”。白色箭头表示死细胞。比例 尺表示20μm。 图5：TMR-GBPW4R诱导TMR-GBP相似的细胞毒性作用。Detroit  562，  H520和H1270， 但不存在于Ca922。将指示的细胞接种在96孔盘中，然后用  TMR-GBP处理48小时，然后进行 WST-8测定。指示细胞的存活率百分比如所示。 图6(A)：H2O2(正向对照组)诱导Ca922中的细胞凋亡。用  Annexin-V-FITC对经1％ 的H2O2处置之Ca922细胞进行正向标记，然后进行流式细胞仪分析。X轴表示荧光强度，Y轴表 示细胞计数。 图6(B)：TMR-GBP诱导Ca922中的细胞凋亡。TMR-GBP触发的细胞凋亡如Annexin-V- FITC染色后进行流式细胞术分析所示。X轴表示荧光强度，  Y轴表示细胞计数。 图6(C)：TMR-GBP导致Ca922凋亡中诱导Bax活化。以25μM  TMR-GBP处理的Ca922细 胞，于指示的时间点检查出促凋亡蛋白Bax的表达。以与对照组细胞的Bax值(0小时)标准化 的比率将所述相对蛋白质水平呈现在所述印渍之下。 图7：TMR-GBP处理诱导了线粒体碎裂和细胞色素c释放。用不同剂量的TMR-GBP处 理Ca922细胞8或24小时，然后用4％甲醛固定。代表性图像显示线粒体标记物TOM20和细胞 色素c的染色。比例尺表示为10μm。 图8(A)：EGTA，BAPTA和NAC不影响Ca922细胞的细胞活性。将Ca922  细胞接种于96 孔盘中，然后用EGTA(乙二醇四乙酸)，BAPTA(1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N，N，N'，N'-四乙 酸)和N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理。透过WST-8测定评估经指示处理后Ca922的细胞存活 率。指示细胞的存活率百分比如所示。 图8(B)：TMR-GBP诱导的细胞毒性被NAC部分抑制。将Ca922细胞接种在96孔盘中， 先以EGTA、BAPTA和NAC预处理2小时后，再以GBP处置。透过WST-8测定法测量细胞活性。对于 10 CN 111588858 A 说　明　书 9/14 页 共同处以TMR-GBP和钙螯合剂  (EGTA，BAPTA-AM)或ROS清除剂NAC的Ca922细胞活性如所示。 三个独立实验的标准偏差表示为条状。 图9：TMR-GBP诱导Ca922细胞中的ROS产生。将Ca922细胞以每孔  25,000个细胞的 浓度，接种在黑暗、透明的96孔微孔盘中。然后以25μM  DCFDA将细胞标记45分钟后再以25μM  TMR-GB培养6小时。以1％H2O2  (1小时)和55mM  TBHP(4小时)处理为正向对照组，模拟ROS活 性以将  DCFDA氧化成荧光DCF。然后在荧光盘读数器上分析细胞。三个独立实验的标准偏差 表示为条状。 图10(A)：TMR-GBP诱导了DNA损伤。DAPI标记的细胞核与磷酸-γ  H2Ax共染色的代 表性图像如所示。用25μM  TMR-GBP处理Ca922细胞12 或24小时，然后进行免疫荧光染色。细 胞核中的病灶表明DNA受损。比例尺表示为10μm。 图10(B)：TMR-GBP处理诱导了DNA损伤。条形图显示了细胞核讯号平均强度的百分 比；条形表示为三次独立实验的标准偏差。 图11(A)：TMR-GBP在没有凋亡蛋白酶活化的情况下诱导PARP裂解在以25μM  TMR- GBP处理6小时的Ca922细胞中检查聚(ADP-核糖)聚合酶  (Poly(ADP-ribose)polymerase， PARP)的蛋白质表达。 图11(B)：TMR-GBP在没有凋亡蛋白酶活化的情况下诱导PARP裂解。用TMR-GBP  25μ M处理的Ca922细胞的蛋白质裂解物以抗半胱天冬酶-3  (caspase-3)、半胱天冬酶-7 (caspase-7)、半胱天冬酶-9(caspase-9)和聚  (ADP-核糖)聚合酶(Poly(ADP-ribose) polymerase，PARP)的抗体印渍。代表性的印渍如所示。 图11(C)：TMR-GBP在没有凋亡蛋白酶活化的情况下诱导PARP裂解。用TMR-GBP处理 Ca922细胞并在指示的时间点收集。然后印渍半胱天冬酶  -3以观察TMR-GBP是否触发了半 胱天冬酶非依赖性凋亡途径  (Caspase-independent  apoptosis  pathway)。 图11(D)：TMR-GBP在没有凋亡蛋白酶活化的情况下诱导PARP裂解。细胞先以钙蛋 白酶(Calpain)抑制剂预处理细胞30分钟后，再以TMR-GBP 处理，然后印渍半胱天冬酶-3。