技术摘要：
利用朱砂烟内生菌复合发酵制备烟草香料的方法，将朱砂烟新鲜烟叶进行表面消毒法操作后，在NA培养基上按照稀涂平板法反复进行分离纯化培养，直至获得单一菌株进行常规保种；取所得纯系内生菌菌株，在LB培养基中进行培养，并对菌株的生长速度及发酵液的香气进行评价，最 全部
背景技术：
朱砂烟为云南优质烟叶的名称，特指带朱砂花纹的烟叶，朱砂花纹遍布叶片正反 面。云烟烟丝的特点是烟丝橙黄鲜明，光泽油润，香味清雅，无杂气，无刺激，余味纯正。而云 烟烟丝的极品就是朱砂烟丝，因为数量稀少，所以价格很高。朱砂烟烟劲中等，味厚实饱满， 醇香无辛辣感，喉部回甘特别明显。致香成分分析表明，朱砂烟的叶黄素和β-胡萝卜素、巨 豆三烯酮和棕榈酸含量显著高于普通烟叶。 植物内生菌是一个多样性十分丰富的微生物类群，分布在没有外部感染的植物组 织内，并与宿主植物协同进化，可能与寄生植株生理生化特性存在着密切的相关性，能产生 丰富多样的具有生物活性的代谢产物。植物内生菌资源的筛选及利用对于生物技术在烟用 香精香料的开发中具有极为重要的意义。 目前有关发酵烟用香料的制备技术有一些公开文献，大多局限于果蔬类原料的发 酵产品开发，并且大部分是利用单一菌株，如中国专利CN105733962B公开了一种黄绿木霉 HLMM-04菌株及制备烟用香料的方法，中国专利CN109722393A公开了一种烟草黄色土源菌 及其分离方法和应用，中国专利CN109136146A公开了一种烟草土壤戴氏菌及其分离方法和 应用，中国专利CN1085 87 960 A公开了一种产香放线菌菌株及其应用，中国专利 CN108330077A公开了一种黄暗色链霉菌及其应用，中国专利CN108220188A公开了一种溶杆 菌及其应用，中国专利CN104195181A公开了一种黄瓜发酵提取物及其制备方法和应用，中 国专利CN107236767A公开了一种用米曲霉发酵胡萝卜制备烟用香料的方法。这些方法均存 在发酵产香的菌株不是来源于烟草原料本身，而且发酵产物香气特征与卷烟产品香气风格 不谐调的不足。 有关复合发酵制备烟草香料的技术也有少量公开文献，如中国专利CN103911419A 公开了一种双菌株联合发酵生产L-缬氨酸的方法，中国专利CN102894467A公开了利用固定 化酶制剂结合醋酸菌发酵制备烟草提取物的方法。这些方法要经过连续2次发酵和处理，工 艺复杂且成本较高，较难实现产业化。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术的不足，开发一种可以提高烟草香料的抽吸品质和 档次，且工艺简单、制备成本低、易于实现产业化的利用朱砂烟内生菌复合发酵制备烟草香 料的方法。 本发明采取的技术方案如下： 利用朱砂烟内生菌复合发酵制备烟草香料的方法，方法步骤如下： (1)内生菌的分离纯化：朱砂烟新鲜烟叶进行表面消毒法操作后，在NA培养基上按 3 CN 111575205 A 说 明 书 2/3 页 照稀涂平板法反复进行分离纯化培养，直至获得单一菌株进行常规保种；取所得纯系内生 菌菌株，在LB培养基中进行培养，并对菌株的生长速度及发酵液的香气进行评价，最终筛选 得到2株优势产香内生菌，经鉴定A菌为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)，B菌为枯草芽孢 杆菌(Bacillussubtilis)； (2)烟用香料的复合发酵：将筛选所得纯系产香内生菌A菌和B菌，同时接种到烟草 提取液中，接入的种子液的质量是处理产物质量的0.1～20％，20～60℃培养2～120h； (3)产品浓缩制备：将发酵产物浓缩处理，即得仿朱砂烟烟草香料。 本发明所述的烟草提取液是指烟末、烟叶、烟叶碎片、烟梗、烟梗碎片中的一种或 几种的提取液。烟草提取液制备方法为现有成熟技术。 本发明对优质的朱砂烟内生菌进行分离纯化，获取纯系内生菌菌株，并筛选出巨 豆三烯酮含量高的短小芽孢杆菌和棕榈酸含量高的枯草芽孢杆菌，进一步采用复合发酵同 时提高产品中的巨豆三烯酮和棕榈酸含量，其中巨豆三烯酮是烟草中最重要的致香成分之 一，具有典型烟草甘甜香气，而棕榈酸在一定程度上可调节烟草的酸碱平衡，降低刺激性并 改善余味，使得香料具有显著的朱砂烟香气特征，显著提高了烟草香料的抽吸品质和档次， 能在整体上调节卷烟的抽吸舒适感和烟气回甘香味。 本发明制备方法工艺简单，只需要一次性复合发酵即可，制备成本低，能够形成工 业化生产，以本方法生产的烟草香料具有显著的朱砂烟香气特征，能够明显提高烟草香料 的抽吸品质和档次。
利用朱砂烟内生菌复合发酵制备烟草香料的方法，将朱砂烟新鲜烟叶进行表面消毒法操作后，在NA培养基上按照稀涂平板法反复进行分离纯化培养，直至获得单一菌株进行常规保种；取所得纯系内生菌菌株，在LB培养基中进行培养，并对菌株的生长速度及发酵液的香气进行评价，最 全部
背景技术：
朱砂烟为云南优质烟叶的名称，特指带朱砂花纹的烟叶，朱砂花纹遍布叶片正反 面。云烟烟丝的特点是烟丝橙黄鲜明，光泽油润，香味清雅，无杂气，无刺激，余味纯正。而云 烟烟丝的极品就是朱砂烟丝，因为数量稀少，所以价格很高。朱砂烟烟劲中等，味厚实饱满， 醇香无辛辣感，喉部回甘特别明显。致香成分分析表明，朱砂烟的叶黄素和β-胡萝卜素、巨 豆三烯酮和棕榈酸含量显著高于普通烟叶。 植物内生菌是一个多样性十分丰富的微生物类群，分布在没有外部感染的植物组 织内，并与宿主植物协同进化，可能与寄生植株生理生化特性存在着密切的相关性，能产生 丰富多样的具有生物活性的代谢产物。植物内生菌资源的筛选及利用对于生物技术在烟用 香精香料的开发中具有极为重要的意义。 目前有关发酵烟用香料的制备技术有一些公开文献，大多局限于果蔬类原料的发 酵产品开发，并且大部分是利用单一菌株，如中国专利CN105733962B公开了一种黄绿木霉 HLMM-04菌株及制备烟用香料的方法，中国专利CN109722393A公开了一种烟草黄色土源菌 及其分离方法和应用，中国专利CN109136146A公开了一种烟草土壤戴氏菌及其分离方法和 应用，中国专利CN1085 87 960 A公开了一种产香放线菌菌株及其应用，中国专利 CN108330077A公开了一种黄暗色链霉菌及其应用，中国专利CN108220188A公开了一种溶杆 菌及其应用，中国专利CN104195181A公开了一种黄瓜发酵提取物及其制备方法和应用，中 国专利CN107236767A公开了一种用米曲霉发酵胡萝卜制备烟用香料的方法。这些方法均存 在发酵产香的菌株不是来源于烟草原料本身，而且发酵产物香气特征与卷烟产品香气风格 不谐调的不足。 有关复合发酵制备烟草香料的技术也有少量公开文献，如中国专利CN103911419A 公开了一种双菌株联合发酵生产L-缬氨酸的方法，中国专利CN102894467A公开了利用固定 化酶制剂结合醋酸菌发酵制备烟草提取物的方法。这些方法要经过连续2次发酵和处理，工 艺复杂且成本较高，较难实现产业化。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术的不足，开发一种可以提高烟草香料的抽吸品质和 档次，且工艺简单、制备成本低、易于实现产业化的利用朱砂烟内生菌复合发酵制备烟草香 料的方法。 本发明采取的技术方案如下： 利用朱砂烟内生菌复合发酵制备烟草香料的方法，方法步骤如下： (1)内生菌的分离纯化：朱砂烟新鲜烟叶进行表面消毒法操作后，在NA培养基上按 3 CN 111575205 A 说 明 书 2/3 页 照稀涂平板法反复进行分离纯化培养，直至获得单一菌株进行常规保种；取所得纯系内生 菌菌株，在LB培养基中进行培养，并对菌株的生长速度及发酵液的香气进行评价，最终筛选 得到2株优势产香内生菌，经鉴定A菌为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)，B菌为枯草芽孢 杆菌(Bacillussubtilis)； (2)烟用香料的复合发酵：将筛选所得纯系产香内生菌A菌和B菌，同时接种到烟草 提取液中，接入的种子液的质量是处理产物质量的0.1～20％，20～60℃培养2～120h； (3)产品浓缩制备：将发酵产物浓缩处理，即得仿朱砂烟烟草香料。 本发明所述的烟草提取液是指烟末、烟叶、烟叶碎片、烟梗、烟梗碎片中的一种或 几种的提取液。烟草提取液制备方法为现有成熟技术。 本发明对优质的朱砂烟内生菌进行分离纯化，获取纯系内生菌菌株，并筛选出巨 豆三烯酮含量高的短小芽孢杆菌和棕榈酸含量高的枯草芽孢杆菌，进一步采用复合发酵同 时提高产品中的巨豆三烯酮和棕榈酸含量，其中巨豆三烯酮是烟草中最重要的致香成分之 一，具有典型烟草甘甜香气，而棕榈酸在一定程度上可调节烟草的酸碱平衡，降低刺激性并 改善余味，使得香料具有显著的朱砂烟香气特征，显著提高了烟草香料的抽吸品质和档次， 能在整体上调节卷烟的抽吸舒适感和烟气回甘香味。 本发明制备方法工艺简单，只需要一次性复合发酵即可，制备成本低，能够形成工 业化生产，以本方法生产的烟草香料具有显著的朱砂烟香气特征，能够明显提高烟草香料 的抽吸品质和档次。
