技术摘要：
本发明公开了一种脱毒蝴蝶兰新品种培育及组培扩繁方法。本发明在果荚自然开裂后，用镊子轻敲果荚，种子可自裂口处蹦出，表面灭菌，用折成漏斗状的灭菌滤纸过滤出种子，从而获得了无附属物的无毒种子，然后无菌播种，获得蝴蝶兰无病毒实生苗，配合田间养护做好病毒防控  全部
背景技术：
蝴蝶兰为兰科蝴蝶兰属植物，因其花形奇特、花姿优美、花色艳丽、花期长等优点， 深受消费者青睐，被誉为“兰花皇后”，常作盆栽或切花。随着国际花卉产业的迅速发展，我 国蝴蝶兰产业呈现出快速化、标准化、规模化的发展态势，发展前景可观。 蝴蝶兰只有一个生长点，属单茎性兰花，所以蝴蝶兰很难进行分株繁殖。目前国际 上常用的繁殖方法是组织培养无性繁殖法。但是长期的组织培养引发的病毒传播越来越 重，目前，在蝴蝶兰上分离得到的病毒超过25种，其中危害最重、分布最广的是建兰花叶病 毒(Cybidium mosaic  virus，CymMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossum  ringspot  virus， ORSV)。病毒传播成为制约兰花产业发展的瓶颈，病毒主要造成植株花叶、畸形、坏死、花瓣 变形等症状，导致植株生长不良，花小而少，花期缩短，严重影响其观赏价值和经济价值。 迄今为止，获得无毒苗的主要途径有茎尖剥离、热处理和病毒抑制剂等方法。其 中，茎尖培养应用最广，但其脱毒效果常受茎尖大小的影响，而且茎尖褐化和死亡率高；热 处理主要利用高温可以抑制病毒的复制及运动蛋白的合成，从而造成病毒钝化失活。然而 研究表明  CymMV和ORSV都具有一定的耐热性，因此，单独热处理对蝴蝶兰脱除CymMV和ORSV  效果不明显；病毒抑制剂方法主要通过抑制剂(孔雀绿、病毒唑和氨基寡糖素等)干扰病毒 在植物体内的复制来达到防治病毒病的目的。但是，病毒抑制剂的浓度很难把控，浓度太大 会使茎尖死亡，浓度小无法实现脱毒。 由于蝴蝶兰脱毒技术成活率低，目前我国大陆蝴蝶兰组培生产所需组培苗母瓶几 乎全部购自中国台湾、荷兰等地，价格昂贵，中国大陆组培厂利用购买的蝴蝶兰母瓶扩繁后 为产业提供组培苗。然而，购买的母瓶往往是很多代扩繁的产物，也会有单病毒或含量比较 低的病毒，随着中国大陆组培操作的不规范，往往扩繁几代生产种苗后就无法继续使用，需 要年年购买。如何获得低成本的无病毒植株是蝴蝶兰产业中的“卡脖子”问题。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明提供了一种脱毒蝴蝶兰新品种培育及组培扩繁方法。本发 明通过开裂果荚的无菌播种，获得蝴蝶兰无病毒实生苗，配合田间养护做好病毒防控，优选 单株在扩繁前进行病毒检测，只选择无病毒的株系进行扩繁，进而在获得新品种的同时获 得无病毒种苗，提供无病毒组培母瓶，缓解蝴蝶兰产业中急需的新品种和无病毒种苗需求。 本发明技术方案是：一种脱毒蝴蝶兰新品种培育及组培扩繁方法，其特征是，包括 以下步骤： 1)获得杂交果荚 选取性状表现优良的父、母本进行杂交获得果荚；将未开裂但发育成熟的果荚进 3 CN 111543322 A 说　明　书 2/5 页 行消毒； 2)开裂果荚播种 将消毒过的果荚放在无菌组培瓶中，使其自然开裂，待果荚开裂后，轻敲果荚，种 子自裂口处蹦出，先次氯酸钠消毒，然后采用折成漏斗状的灭菌滤纸过滤出种子，再播种到 培养基上； 3)无菌培养获得组培实生苗 将种子暗处理2周，之后进行正常的培养，实生苗田间养护期间配合做好病毒防 控； 4)优秀实生单株扩繁 实生苗开花后，挑选出优秀的实生单株，逐一进行病毒检测，显示不含建兰花叶病 毒和齿兰环斑病毒的单株在组培室内进行蝴蝶兰花梗组培扩繁，获得初代母瓶； 5)保留组培母瓶 在经过品种测试后，确定推广应用的品种，直接从组培室内用初代母瓶进行扩繁， 确保种苗不含建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒，生产过程中根据组培苗长势进行复壮扩增。 优选的，所述步骤1)将未开裂但发育成熟的果荚进行消毒，具体为：将未开裂但发 育成熟的果荚，用75％乙醇仔细擦拭果荚表面及沟纹，将一些污垢和尘土擦拭干净，然后将 整个果荚放入消毒过的容器中，用0.5％的次氯酸钠消毒15-18分钟，无菌水冲洗2～3次，吸 干待用。 优选的，所述步骤2)次氯酸钠消毒为：采用0.5％的次氯酸钠消毒8-10分钟。 优选的，所述步骤2)的培养基为：花宝1号 香蕉50g/L 蛋白胨2g/L 蔗糖20g/L   琼脂8g/L 活性炭2g/L，pH  5.4～5.6。 优选的，所述步骤2)的正常的培养为：光照强度2500lx，光周期14h，温度保持在20  ～26℃。 相比现有技术，本发明的优势是： 1、获得无附属物的无病毒蝴蝶兰种子和无病毒实生苗 蝴蝶兰的种子非常特别，每个果荚内种子量巨大，上万至几十万，种子细如粉尘， 附着在绒毛上。 现有技术采用果荚切开获得种子，果荚内切出的都是絮状物的绒毛，这些絮状物 的绒毛上面有种子，种子细如粉尘，肉眼看不到，无法使用工具取出果荚内细如粉尘的种 子，只能得到带绒毛等附属物的种子，绒毛由母本细胞分化而来，因此携带有病毒；而种子 为胚细胞发育而来，父母本各提供一半的遗传物质，由于建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒都 是RNA病毒，因此胚细胞发育而成的种子不含病毒。 针对上述问题，本发明在果荚自然开裂后，用镊子轻敲果荚，种子可自裂口处蹦 出，表面灭菌，用折成漏斗状的灭菌滤纸过滤出种子，从而获得了无附属物的无毒种子。 本发明采用两次灭菌法，果荚灭菌--种子灭菌，利用无附属物的种子进行无菌播 种，截断病毒代代传播的途径，通过无菌播种获得无病毒实生苗。 2、将新品种选育和无病毒种苗的获得结合在一起 本发明首先获得开裂果荚的无附属物的无毒种子，通过无菌播种获得无病毒实生 苗，制定严格的温室、管理、操作、检测流程，确保生长过程中的病毒无感染；优选单株在扩 4 CN 111543322 A 说　明　书 3/5 页 繁前进行病毒检测，只选择无病毒的株系进行扩繁，进而在获得新品种的同时获得无病毒 种苗，提供无病毒组培母瓶，缓解蝴蝶兰产业中急需的新品种和无病毒种苗需求。本发明将 新品种选育和无病毒种苗的获得结合在一起，解决了品种脱毒种苗获得极其困难的问题， 可以改变中国大陆组培厂去中国台湾买母瓶的现状。 备注：本发明中提到的“无病毒”种苗并不是绝对的不含有任何病毒，而是不含在 生产中会影响商品性的两种主要病毒；也不是绝对意义上的无毒苗，存在病毒含量极低，检 测不出来的情况，但均不影响商品性。 附图说明 图1为不开裂蝴蝶兰果荚通过解剖刀切开后的图片，其中A图为切开果荚的图片，B 为从果荚内取出的绒毛图片；从图中可以看出：从果荚内切出的都是絮状物的绒毛，这些絮 状物的绒毛上面有种子，种子细如粉尘，肉眼看不到，无法使用工具(如刀片等)取出果荚内 细如粉尘的种子，只能得到带绒毛的种子； 图2为蝴蝶兰果荚自然开裂后的种子获取图片，其中A图为镊子轻敲果荚后种子可 自裂口处蹦出；B图为种子灭菌图片；C图为将滤纸折成漏洞状，用灭菌滤纸过滤出种子； 图3为蝴蝶兰建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒RT-PCR产物电泳图；其中，M：Marker；  A1、A2、A3为切开果荚得到种子后的播种苗；B1、B2、B3为果荚自然开裂得到种子后的播种 苗；769bp为建兰花叶病毒特异扩增带。