技术摘要：
本发明公开了一种C21甾体在制备促进癌细胞凋亡药物中的应用，所述C21甾体通过抑制自噬促进细胞凋亡而抑制细胞的增殖。还公开了一种C21甾体在制备治疗胃癌药物中的应用，所述C21甾体为乌骨藤提取物，所述C21甾体通过抑制自噬促进凋亡而抑制胃癌细胞增殖。本发明公开的C2  全部
背景技术：
胃癌是全球第三大最常见的癌症，也是癌症相关死亡的主要原因之一。缺乏有效 的治疗手段导致癌症患者生存周期短和生活质量差。并且目前，主要是通过手术切除和化 疗治疗胃癌患者，但其治疗效果有限。因此，迫切需要开发新的治疗方案来改善患者的预 后。 自噬是一种保守的真核分解代谢反应，它可以分解代谢细胞质蛋白和细胞器。作 为一种细胞保护过程，它有助于维持癌细胞的稳态，并在恶劣环境下作为替代能源。这表明 自噬在肿瘤的发展中可能具有保护作用。最近的研究表明，关键的自噬基因，包括自噬相关 基因(ATG)，可以通过细胞死亡引起细胞ROS损伤。Cully  et.发现调节抑癌基因PTEN和p53 的表达可以积极地调节自噬。众所周知，像BCL2抗凋亡蛋白这样的癌基因产物与进化上保 守的自噬蛋白相互作用，与Beclin-1结合可能有助于将自噬维持在与细胞生存兼容的水 平。关于胃癌，最近有研究表明自噬对疾病有双重影响。许等人研究表明抗癌药物木通皂苷 PA通过激活自噬和凋亡来促进AGS细胞的凋亡。相反，另一项研究报告称，自噬抑制剂的使 用增强了抗癌药物在胃癌细胞系SGC-7901中的细胞毒性。因此，自噬可能是治疗胃癌的潜 在治疗靶点。 乌骨藤(Marsdenia  Tenacissima)是一种瓜馥木属植物，在我国广泛生产，其液体 提取物(商品名：消癌平)已被批准用于治疗食管癌、肺癌、白血病、肝癌和胃癌。已经发现 MTE中富含C21甾体苷，FR5组分处理可以通过PTEN-AKT-mTOR信号通路诱导细胞凋亡。然而， C21甾体对自噬的潜在功效以及自噬抑制是否能促进C21的抗癌作用尚未被研究。 因此，本发明主要检查C21甾体是否可以诱导自噬，以及自噬抑制是否有助于C21 提取物的抗癌作用，同时还探索了诱导自噬的潜在分子机制。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种C21甾体在制备增强癌细胞凋亡药物中的应用，以解决 上述现有技术存在的问题，C21甾体可以明显的抑制癌细胞生长和促进细胞凋亡，以抑制细 胞增殖。 本发明的目的还提供一种C21甾体在制备治疗胃癌药物中的应用，C21甾体具有诱 导胃癌细胞凋亡和自噬增加的作用，为揭示C21甾体抗胃癌活性的新机制提供理论基础。 为实现上述目的，本发明提供了如下方案： 本发明提供一种C21甾体在制备促进癌细胞凋亡药物中的应用，所述C21甾体通过 抑制自噬促进细胞凋亡而抑制癌细胞的增殖。 3 CN 111603474 A 说　明　书 2/6 页 优选的是，所述C21甾体通过激活AKT促进自噬途径发生。 优选的是，所述C21甾体为乌骨藤提取物。 优选的是，所述癌细胞为胃癌细胞。 本发明还提供一种C21甾体在制备治疗胃癌药物中的应用，所述C21甾体为乌骨藤 提取物，所述C21甾体通过抑制自噬促进凋亡而抑制胃癌细胞的增殖。 本发明公开了以下技术效果： 由于PI3K/Akt通路的激活已被证明在许多类型的肿瘤中，它有助于肿瘤细胞的增 殖和存活。在本发明中，通过实验验证经C21甾体处理的BGC-823和AGS细胞中p-AKT的显著 减少，表明C21甾体可能通过PTEN-AKT信号通路诱导细胞凋亡。并且发明人在先前的研究中 证实，乌骨藤提取物C21甾体可以通过PTEN/AKT/mTOR信号通路诱导肝癌细胞凋亡。PI3K/ Akt/mTOR途径已被证明在调节自噬中起到负面作用，它的下降实际上会激活自噬；还发现 自噬相关蛋白(ATG)在调节自噬相关基因编码的自噬小体的形成中起着特殊的作用。在本 发明中，自噬相关蛋白ATG5和Beclin-1在C21甾体诱导自噬时增加，当自噬抑制发生时降 低，进一步表明C21甾体可以激活胃癌细胞中的自噬，说明C21甾体可能通过抑制PI3K/Akt/ mTOR信号通路在胃癌细胞中诱导保护性自噬。本发明表明C21甾体可抑制胃癌细胞增殖，诱 导胃癌细胞凋亡和自噬；具体的，C21甾体通过抑制自噬而增强胃癌细胞凋亡，部分归因于 AKT的激活，因此，C21甾体将成为是从天然化合物中提取的用于治疗胃癌的一种新的候选 药物。 附图说明 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所 需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施 例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获 得其他的附图。 图1为C21甾体抑制胃癌细胞增殖作用；a-c分别为不同浓度C21甾体抑制BGC-823、 SGC-7901和AGS细胞增殖结果：用C21甾体(0，40，80，160μg/mL处理胃癌细胞，用GraphPad的 Prism软件分析实时细胞检测仪结果；用C21甾体(0，20，40，80，160，320μg/ml)处理胃癌细 胞，用GraphPad的Prism软件分析MTS结果，P<0.05，vs  NC； 图2为用0，80μg/mL和160μg/mL  C21甾体处理24h，诱导胃细胞BGC823和AGS细胞周 期阻滞和凋亡；a：用染色缓冲液A和试剂B染色后，用流式细胞仪测定细胞计数(％)；b:细胞 周期统计图；c：用Annexin-V-异硫氰酸荧光素(FITC)和PI染色后，用流式细胞仪测定细胞 凋亡率；左下角显示正常比率，右下角显示早期凋亡，右上角显示晚期凋亡；d：细胞凋亡率 统计图；e：蛋白质印迹分析测定cleaved-PARP蛋白水平，以β-肌动蛋白为对照；f：Cleaved- PARP的表达率统计；*P<0.05，vs  NC； 图3为C21甾体处理促进胃癌自噬的发生；a：在没有或存在CQ(20μM)的情况下用 C21甾体(100μg/mL)处理24h后，共聚焦显微镜观察到绿色荧光蛋白-LC3(绿色)的共定位； b：将细胞暴露于C21甾体(120μg/mL)和CQ(20μM)作用24h后，采用western  blot分析测定 LC3蛋白水平，以GAPDH作为对照；c：定量LC3-II的表达率统计；*P<0.05，vs  NC； 图4为C21甾体联合CQ促进细胞凋亡；a：用Annexin-V-FITC和PI染色后，用流式细 4 CN 111603474 A 说　明　书 3/6 页 胞仪测定细胞凋亡率；左下角为正常比率，右下角为早期凋亡，右上角为晚期凋亡；b：分别 定量细胞凋亡百分率；C：DCFH-DA染色后，定量测定ROS水平；a-b：将细胞暴露于C21甾体 (120μg/mL)和CQ(20μM)作用24h后，用western  blot分析自噬相关蛋白，以GAPDH作为对照； c：量化Beclin-1的表达率；d：定量ATG-5的表达率；e：定量BCL-2的表达率；*P<0.05，vs  NC； 图5为C21甾体通过AKT信号通路干扰自噬；a-b：分别为BGC-823和AGS细胞暴露于 C21甾体(120μg/mL)和CQ(20μM)作用24h后，通过Western  blot分析确定与凋亡相关的蛋 白，并以GAPDH作为对照；c：量化Beclin-1的表达率；d：定量ATG-5的表达率；e：量化p-AKT的 表达率；*P<0.05，vs  NC。