技术摘要：
本发明公开了一种免提取直接扩增检测三高类用药基因多态性的引物组和探针、试剂盒及其方法。所述引物组和探针的序列如SEQ ID NO:1‑32所示，其中SEQ ID NO:1‑2；5‑6,9‑10；13‑14；17‑18；21‑22；25‑26；29‑30为引物，SEQ ID NO:3‑4,7‑8,11‑12；15‑16；19‑  全部
背景技术：
近年来，荧光PCR技术得到了越来越广泛的应用。常规通过荧光PCR检测核酸的方 法一般需要两个独立的过程：一是核酸模板制备，二是将核酸模板加入反应体系中进行PCR 扩增检测。 人基因组DNA提取方法非常的多，DNA提取主要是CTAB方法，其他的方法还有物理 方式如玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法。化学方式如异硫氰酸胍法、碱裂解法。生物方 式：酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有硅质材料、阴离子交换树脂等。 以上这些提取方法均需要借助专业的提取设备和耗材、提取试剂，操作人员需要 熟练掌握提取操作技能。通过提取处理虽然可以获得纯度比较高的核酸，但是核酸提取过 程往往会导致80-90％以上的核酸损失，同时繁琐的提纯步骤增加了检测成本并且提取过 程耗时长，还有增加后续荧光PCR扩增失败的可能。因此，样本能够直接作为模板或经过简 单处理就能够作为模板进行荧光PCR扩增检测，成为样本荧光PCR扩增亟待解决的难题。
技术实现要素：
本发明目的是提供一种免提取直接扩增检测三高(高血压、高血脂、高血糖)类用 药基因多态性检测的试剂盒以及方法。旨在解决现有技术对样本进行PCR扩增时，需要预先 对样本进行核酸提取纯化处理，从而导致核酸大量损失、且有毒试剂使用的问题，缩短PCR 检测时间和简化操作步骤。 本发明目的是提供高效快速检测三高(高血压、高血脂、高血糖)类药物用药涉及 的高血脂用药中他汀类相关的rs4149056、rs429358、rs7412；高血压用药中：叶酸相关的 rs1801133、氨氯地平相关的rs776746、氢氯噻嗪相关的rs4961；高血糖用药中：磺脲类相关 的rs5219、双胍类相关的rs11212617共8个位点的基因多态性；给予正确的基因多态性位点 分型。 为实现上述目的，本发明提供一种免提取直接扩增检测三高类用药基因多态性的 引物组和探针，其特征在于，所述引物组和探针的序列如SEQ  ID  NO:1-32所示，其中SEQ  ID  NO:1-2；5-6,9-10；13-14；17-18；21-22；25-26；29-30为引物，SEQ  ID  NO:3-4,7-8,11-12； 15-16；19-20；23-24；27-28；31-32为探针，探针的5'、3'末端分别标记荧光基团和淬灭基 团。 本发明还提供一种免提取直接扩增检测三高类用药基因多态性的试剂盒，其特征 在于，含有所述的引物组和探针。 进一步，还含有阳性质粒对照品，10×PCR反应液、dNTP、Mg2 和Taq  DNA聚合酶，阳 4 CN 111549118 A 说　明　书 2/12 页 性质粒对照品的序列如SEQ  ID  NO:33-38所示。 本发明还提供一种免提取并同时富集三高类用药基因8个位点的特异性DNA片段 的方法，其特征在于，使用了所述的引物组和探针中的引物组，或所述的试剂盒。 进一步，所述方法采用了PCR扩增，PCR扩增的预扩反应体系为， 25μl的反应体系：3μl检测样本，10×PCR反应液，Taq  DNA聚合酶，终浓度为 2.5mmol/L的dNTP，终浓度为3.5mmol/L的Mg2 ，终浓度为5umol/L的Oligo  Mix，余量为无菌 水；所述Oligo  Mix含有等量的SEQ  ID  NO:1,2,5,6,9，10，13，14,17,18,21,22,25,26,29, 30； PCR扩增的预扩反应程序为： 第一步骤：95℃5min；循环1次； 第二步骤：94℃30s；56℃30s；72℃30s；循环22次； 第三步骤：72℃10min；循环1次。 进一步，所述检测样本为全血、血清、血浆、分离或浓缩的红细胞成分、血纱、血片、 指尖血、口腔拭子或唾液等； 优选的，如果检测样本是液体状则无需处理直接作为检测样本；如果样本是固状 样本(如口腔拭子、血纱或血片等)时，将新鲜采集的固状样本放置于无菌水中使其混悬，得 到的混悬液作为检测样本。 本发明还提供一种免提取直接扩增并检测人三高类用药基因多态性的方法，其特 征在于，使用了所述的引物组和探针，或所述的试剂盒。 进一步，包括如下步骤，采用权利要求1的引物组和探针，或权利要求2的试剂盒， 对权利要求4得到的富集三高类用药基因8个位点的特异性DNA片段进行检测与分型。 进一步，所述检测与分型步骤中使用了荧光PCR，荧光PCR的反应体系为， 25μL的PCR反应体系：2μL的权利要求4所得的稀释液，10×PCR反应液，0.5U  Taq  DNA聚合酶，终浓度为2.5mmol/L的dNTP，终浓度为3.5mmol/L的Mg2 ，Oligo  Mix  X，Oligo  Mix  X包括终浓度为0.4mmol/L的上游引物,终浓度为0.4mmol/L的下游引物,终浓度分别为 0.1mmol/L的两个探针；所述Oligo  Mix  X为Oligo  Mix  A或B或C或D或E或F或G或H；Oligo  Mix  A包括的是终浓度分别为0.4mmol/L的SEQ  ID  NO:1和2,终浓度分别为0.1mmol/L的探 针，探针序列如SEQ  ID  NO:3和4；Oligo  Mix  B包括的是终浓度分别为0.4mmol/L的SEQ  ID  NO:5和6,终浓度分别为0.1mmol/L的探针，探针序列如SEQ  ID  NO:7和8；……，Oligo  Mix  H 包括的是终浓度分别为0.4mmol/L的SEQ  ID  NO:29和30,终浓度分别为0.1mmol/L的探针， 探针序列如SEQ  ID  NO:31和32； 荧光PCR扩增的反应程序为： 第一步骤：95℃，5min，循环1次； 第二步骤：95℃，10s；65℃，30s；循环6次，0.5°touchdown不收集荧光； 第三步骤：95℃，10s；60℃，30s；循环45次，收集荧光； 根据荧光PCR的CT值区分分型的判断标准如下： 第一：FAM通道有S型扩增曲线且CT值<34；HEX无S型扩增曲线或者有S型扩增曲线 且CT>30,且|CTFAM-CTHEX|>3,TT1-TT3均为GG型.XY1-XY3均为GG，XT1为GG型，XT2为CC型； 第二：FAM、HEX通道均有S型扩增曲线且CT值<34，且CTFAM-CTHEX|≤3，TT1-TT3均 5 CN 111549118 A 说　明　书 3/12 页 为AG型，XY1-XY2均为AG型，XY3为GT型，XT1为AG型，XT2为AC型； 第三：FAM无S型扩增曲线或者有S型扩增曲线且CT>30，且|CTFAM-CTHEX|>3；HEX通 道有S型扩增曲线且CT值<34,为TT1-TT3均为AA型，XY1-XY2均为AA型，XY3为TT型，XT1-XT2 均为AA型。 本发明的目的通过以下技术方案实现： 本发明提供两步法对待检样本进行精准的检测：第一步对待测靶标基因DNA片段 进行预扩增，目的是为了富集待测靶标基因DNA片段；第二步则是根据富集的待测靶标基因 DNA片段进行荧光PCR检测，该步骤能准确的得出待测靶标基因的多态性位点分型。 本发明首先提供一种预扩增的方法同时对高血脂rs4149056、rs429358、rs7412三 个位点；高血压rs1801133、rs776746、rs4961三个位点；高血糖rs5219、rs11212617两个位 点的特异性DNA片段进行富集。 1)根据三个待测靶标基因位点进行设计的预扩增PCR反应体系为：10×PCR反应 液、dNTP、Mg2 、Oligo  Mix、Taq  DNA聚合酶。 所述Oligo  Mix分别含有： rs4149056的正向引物即TT1-F：TACTATGGGAGTCTCCCCTATT；SEQ  ID  NO:1； rs4149056的反向引物即TT1-R：TTGTTTAAAGGAATCTGGGTCAT；SEQ  ID  NO:2； rs429358的正向引物即TT2-F：ATGGCCTGCACCTCGCCG；SEQ  ID  NO:5； rs429358的反向引物即TT2-R：ACGGCTGTCCAAGGAGCT；SEQ  ID  NO:6； rs7412的正向引物即TT3-F：ATGGCGCTGAGGCCGCGCT；SEQ  ID  NO:9； rs7412的反向引物即TT3-R：TCGCCTCCCACCTGCGCA。SEQ  ID  NO:10； rs1801133的正向引物即XY1-F：ATGGCGCTGAGGCCGCGCT；SEQ  ID  NO:13； rs1801133的反向引物即XY1-R：TCGCCTCCCACCTGCGCA；SEQ  ID  NO:14； rs776746的正向引物即XY2-F：GTACCACCCAGCTTAACGAATGCT；SEQ  ID  NO:117； rs776746的反向引物即XY2-R：CCTTAGGTTCTAGTTCATTAGGGT；SEQ  ID  NO:18； rs4961的正向引物即XY3-F：AGCAGTTGGTAATACAGCTTGGCA；SEQ  ID  NO:21； rs4961的反向引物即XY3-R：GGGGCGACGAAGCTTCCGA；SEQ  ID  NO:22； rs5219的正向引物即XT1-F：GCCACGTTGCAGTTGCCTTT；SEQ  ID  NO:25； rs5219的反向引物即XT1-R：CGAGGAATACGTGCTGACAC；SEQ  ID  NO:26； rs11212617的正向引物即XT2-F：TGGGTTGCTTGTGGATAACATATA；SEQ  ID  NO:29； rs11212617的反向引物即XT2-R：AATGATCTACATATACCAATTACAAAGGG；SEQ  ID  NO: 30。 2)采用本发明的试剂盒和检测样本，通过在普通PCR仪上运行PCR扩增程序，本发 明将检测样本直接作为模板，无需处理直接加入PCR反应体系中进行检测。普通PCR仪器操 作简单且高效，对待测靶标基因退火温度的扩增。该普通PCR仪器可以采用XP基因扩增仪系 列(杭州博日科技有限公司，中国)等。 3)所述的检测样本，包括但不限于全血、血清、血浆、血纱、血片、指尖血、口腔拭 子、唾液等。 4)如果所述的检测样本是液体状则无需处理；如果检测样本是口腔拭子、血片、血 纱等固状样本时，可进行简单处理，例如，将新鲜采集的植绒拭子放置于200μl纯净水剧烈 6 CN 111549118 A 说　明　书 4/12 页 旋涡混悬至少15s以上，作为检测样本。 所述扩增程序如下： 第一步骤：95℃5min；循环一次； 第二步骤：94℃30s；56℃30s；72℃30s；循环22次； 第三步骤：72℃10min；循环一次。 所述富集到的PCR产物进行开盖稀释：选择一个密闭的、安全的、不易造成实验室 污染的空间做PCR产物稀释：用稀释40倍后的PCR产物作为模板进入下一步荧光定量PCR检 测反应。 本发明提供一种免提取直接扩增检测人三高(高血压、高血脂、高血糖)类用药基 因多态性的试剂盒，所述试剂盒包括： 1)根据八个基因位点进行设计的三个反应体系分别包含： 反应体系TT1：10×PCR反应液、dNTP、Mg2 、Oligo  Mix  A、Taq  DNA聚合酶； 反应体系TT2：10×PCR反应液、dNTP、Mg2 、Oligo  Mix  B、Taq  DNA聚合酶、DMSO； 反应体系TT3：10×PCR反应液、dNTP、Mg2 、Oligo  Mix  C、Taq  DNA聚合酶、DMSO。 反应体系XY1：10×PCR反应液、dNTP、Mg2 、Oligo  Mix  D、Taq  DNA聚合酶； 反应体系XY2：10×PCR反应液、dNTP、Mg2 、Oligo  Mix  E、Taq  DNA聚合酶； 反应体系XY3：10×PCR反应液、dNTP、Mg2 、Oligo  Mix  F、Taq  DNA聚合酶。 反应体系XT1：10×PCR反应液、dNTP、Mg2 、Oligo  Mix  G、Taq  DNA聚合酶、DMSO； 反应体系XT2：10×PCR反应液、dNTP、Mg2 、Oligo  Mix  H、Taq  DNA聚合酶。 每个反应体系中均可以添加DMSO，以提高体系检测灵敏度。如果体系中的引物和 探针序列为高GC含量，就要加DMSO降低退火温度。 阳性质粒对照品TT-G和TT-A：阳性质粒为rs4149056、rs429358、rs7412三个待测 靶标基因位点共用，质粒序列包含了三个基因位点的多态性，即三个体系的阳性对照均是 加入同样的质粒对照品，每个体系均需要做阳性对照品。 阳性质粒对照品XY-G和XY-AT：阳性质粒为rs1801133、rs776746、rs4961三个待测 靶标基因位点共用，质粒序列包含了三个基因位点的多态性，即三个体系的阳性对照均是 加入同样的质粒对照品，每个体系均需要做阳性对照品。 阳性质粒对照品XT-GC和XT-A：阳性质粒为rs5219、rs11212617两个个待测靶标基 因位点共用，质粒序列包含了两个基因位点的多态性，即两个体系的阳性对照均是加入同 样的质粒对照品，每个体系均需要做阳性对照品。 阴性对照品。 所述Oligo  Mix  A分别含有： rs4149056的正向引物即TT1-F：TACTATGGGAGTCTCCCCTATT；SEQ  ID  NO:1； rs4149056的反向引物即TT1-R：TTGTTTAAAGGAATCTGGGTCAT；SEQ  ID  NO:2； rs4149056的探针1即TT1-P1：FAM-ACCCATGAACGCATATATCCACA-BHQ；SEQ  ID  NO:3； rs4149056的探针2即TT1-P2：HEX-ACCCATGAACACATATATCCACATGT-BHQ；SEQ  ID  NO:4。 所述Oligo  Mix  B分别含有： rs429358的正向引物即TT3-F：ATGGCCTGCACCTCGCCG；SEQ  ID  NO:5； 7 CN 111549118 A 说　明　书 5/12 页 rs429358的反向引物即TT3-R：ACGGCTGTCCAAGGAGCT；SEQ  ID  NO:6； rs429358的探针1即TT3-P1：FAM-CCGCGCACGTCCTCCAT-BHQ；SEQ  ID  NO:7； rs429358的探针2即TT3-P2：HEX-CCGCACACGTCCTCCATGT-BHQ；SEQ  ID  NO:8。 所述Oligo  Mix  C分别含有： rs7412的正向引物即TT3-F：ATGGCGCTGAGGCCGCGCT；SEQ  ID  NO:9； rs7412的反向引物即TT3-R：TCGCCTCCCACCTGCGCA；SEQ  ID  NO:10； rs7412的探针1即TT3-P1：FAM-TACACTGCCAGGCGCTTCT-BHQ；SEQ  ID  NO:11； rs7412的探针2即TT3-P2：HEX-CACTGCCAGGCACTTCTGC-BHQ；SEQ  ID  NO:12。 所述Oligo  Mix  D分别含有： rs1801133的正向引物即XY1-F：ATGGCGCTGAGGCCGCGCT；SEQ  ID  NO:13； rs1801133的反向引物即XY1-R：TCGCCTCCCACCTGCGCA；SEQ  ID  NO:14； rs1801133的探针1即XY1-P1：FAM-TGATGATGAAATCGGCTCCCG-BHQ；SEQ  ID  NO:15； rs1801133的探针2即XY1-P2：HEX-TGATGAAATCGACTCCCGCA-BHQ；SEQ  ID  NO:16。 所述Oligo  Mix  E分别含有： rs776746的正向引物即XY2-F：GTACCACCCAGCTTAACGAATGCT；SEQ  ID  NO:17； rs776746的反向引物即XY2-R：CCTTAGGTTCTAGTTCATTAGGGT；SEQ  ID  NO:18； rs776746的探针1即XY2-P1：FAM-TTTTGTCTTTCAGTATCTCTTCCC-BHQ；SEQ  ID  NO: 19； rs776746的探针2即XY2-P2：HEX-TTTGTCTTTCAATATCTCTTCCCTG-BHQ；SEQ  ID  NO: 20。 所述Oligo  Mix  F分别含有： rs4961的正向引物即XY3-F：AGCAGTTGGTAATACAGCTTGGCA；SEQ  ID  NO:21； rs4961的反向引物即XY3-R：GGGGCGACGAAGCTTCCGA；SEQ  ID  NO:22； rs4961的探针1即XY3-P1：FAM-TCCGAGGAAGGGCAGAATG-BHQ；SEQ  ID  NO:23； rs4961的探针2即XY3-P2：HEX-CTTCCGAGGAATGGCAGAATG-BHQ；SEQ  ID  NO:24。 所述Oligo  Mix  G分别含有： rs5219的正向引物即XT1-F：GCCACGTTGCAGTTGCCTTT；SEQ  ID  NO:25； rs5219的反向引物即XT1-R：CGAGGAATACGTGCTGACAC；SEQ  ID  NO:26； rs5219的探针1即XT1-P1：FAM-CCTGCCGAGCCCAGGT-BHQ；SEQ  ID  NO:27； rs5219的探针2即XT1-P2：HEX-CCCTGCCAAGCCCAGGT-BHQ；SEQ  ID  NO:28。 所述Oligo  Mix  H分别含有： rs11212617的正向引物即XT2-F：TGGGTTGCTTGTGGATAACATATA；SEQ  ID  NO:29； rs11212617的反向引物即XT2-R：AATGATCTACATATACCAATTACAAAGGG；SEQ  ID  NO: 30； rs11212617的探针1即XT2-P1：FAM-CGCTCTGACAGTCTCTGATC-BHQ；SEQ  ID  NO:31； rs11212617的探针2即XT2-P2：FAM-CGCTCTGACATTCTCTGATCT-BHQ；SEQ  ID  NO:32。 所述的5'、3'末端标记的荧光基团包括但不限于ALEXA350、FAM、HEX、TET、JOE、 VIC、ROX、Texas  Red、Cy5、Cy5.5、TAMRA等。所述的淬灭基团包括Dabcyl、BHQ-1、QYS-7、BHQ- 2。5'及3'末端标记的荧光基团和相对应的淬灭基团在折叠状态时能发生荧光共振能量转 8 CN 111549118 A 说　明　书 6/12 页 移(FRET)，使荧光基团的荧光被淬灭。 所述阳性质粒对照品包含： TT-G:AAATCATCAATGTAAGAAAGCCCCAATGGTACTATGGGAGTCTCCCCTATTCCACGAAGCATA TTACCCATGAACGCATATATCCACATGTATGACCCAGATTCCTTTAAACAACCTATGTAGATAAGAGAGTGTTTCA TTTTAAACATTACAGGGGCCCCAGGCGCTCGCGGATGGCGCTGAGGCCGCGCTCGGCGCCCTCGCGGGCCCCGGCC TGGTACACTGCCAGGCGCTTCTGCAGGTCATCGGCATCGCGGAGGAGCCGCTTACGCAGCTTGCGCAGGTGGGAGG CGAGGCGCACCCGCAGCTCCTCGGTGCTCTGGCCGAGCATGGCCTGCACCTCGCCGCGGTACTGCACCAGGCGGCC GCGCACGTCCTCCATGTCCGCGCCCAGCCGGGCCTGCGCCGCCTGCAGCTCCTTGGACAGCCGTGCCCGCGTCTCC TCCGCCA。 SEQ  ID  NO:33。 TT-A:AAATCATCAATGTAAGAAAGCCCCAATGGTACTATGGGAGTCTCCCCTATTCCACGAAGCATA TTACCCATGAACACATATATCCACATGTATGACCCAGATTCCTTTAAACAACCTATGTAGATAAGAGAGTGTTTCA TTTTAAACATTACAGGGGCCCCAGGCGCTCGCGGATGGCGCTGAGGCCGCGCTCGGCGCCCTCGCGGGCCCCGGCC TGGTACACTGCCAGGCACTTCTGCAGGTCATCGGCATCGCGGAGGAGCCGCTTACGCAGCTTGCGCAGGTGGGAGG CGAGGCGCACCCGCAGCTCCTCGGTGCTCTGGCCGAGCATGGCCTGCACCTCGCCGCGGTACTGCACCAGGCGGCC GCACACGTCCTCCATGTCCGCGCCCAGCCGGGCCTGCGCCGCCTGCAGCTCCTTGGACAGCCGTGCCCGCGTCTCC TCCGCCA。 SEQ  ID  NO:34。 XY-G:GCCTTCACAAAGCGGAAGAATGTGTCAGCCTCAAAGAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCGGCT CCCGCAGACACCTTCTCCTTCAAGTGCTTCAGGTCAGCCTCAAAGCTCCCTGCTTCGGGGTGGCCTTTGGGGTAAC CTGCCAATAGGGTACCACCCAGCTTAACGAATGCTCTACTGTCATTTCTAACCATAATCTCTTTAAAGAGCTCTTT TGTCTTTCAGTATCTCTTCCCTGTTTGGACCACATTACCCTTCATCATATGAAGCCTTGGGTGGCTCCTGTGTGAG ACTCTTGCTACAGTTTTCAGAAGCAGCAGCGGGAGAAGACAAGATGGCTGAACTCTGGCCGGGGCGACGAAGCTTC CGAGGAAGGGCAGAATGGAAGCAGTCCCAAGTCGAAGACTAAGGTGTGGACGAACATTACACACGATCACGTGAAA CCCTTGC。 SEQ  ID  NO:35。 XY-AT:GCCTTCACAAAGCGGAAGAATGTGTCAGCCTCAAAGAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCGAC TCCCGCAGACACCTTCTCCTTCAAGTGCTTCAGGTCAGCCTCAAAGCTCCCTGCTTCGGGGTGGCCTTTGGGGTAA CCTGCCAATAGGGTACCACCCAGCTTAACGAATGCTCTACTGTCATTTCTAACCATAATCTCTTTAAAGAGCTCTT TTGTCTTTCAATATCTCTTCCCTGTTTGGACCACATTACCCTTCATCATATGAAGCCTTGGGTGGCTCCTGTGTGA GACTCTTGCTACAGTTTTCAGAAGCAGCAGCGGGAGAAGACAAGATGGCTGAACTCTGGCCGGGGCGACGAAGCTT CCGAGGAATGGCAGAATGGAAGCAGTCCCAAGTCGAAGACTAAGGTGTGGACGAACATTACACACGATCACGTGAA ACCCTTGC。 SEQ  ID  NO:36。 XT-GC:CACCGGAGCCATGCTGTCCCGCAAGGGCATCATCCCCGAGGAATACGTGCTGACACGCCTGG CAGAGGACCCTGCCGAGCCCAGGTACCGTGCCCGCCAGCGGAGGGCCCGCTTTGTGTCCAAGAAAGGCAACTGCAA CGTGGCCCACAATGTGTCTTTATATTTAAAGTGGGTTGCTTGTGGATAACATATAGTTGGGTCTTGATTTTTTATC CGCTCTGACAGTCTCTGATCTGCCCTTTGTAATTGGTATATGTAGATCATTGACATTTAAAGTTATTGATATAGTT CAATCGATAT。 9 CN 111549118 A 说　明　书 7/12 页 SEQ  ID  NO:37。 XT-A:CACCGGAGCCATGCTGTCCCGCAAGGGCATCATCCCCGAGGAATACGTGCTGACACGCCTGGC AGAGGACCCTGCCAAGCCCAGGTACCGTGCCCGCCAGCGGAGGGCCCGCTTTGTGTCCAAGAAAGGCAACTGCAAC GTGGCCCACAATGTGTCTTTATATTTAAAGTGGGTTGCTTGTGGATAACATATAGTTGGGTCTTGATTTTTTATCC GCTCTGACATTCTCTGATCTGCCCTTTGTAATTGGTATATGTAGATCATTGACATTTAAAGTTATTGATATAGTTC AATCGATAT。 SEQ  ID  NO:38。 2)本发明将上一步稀释的PCR产物直接作为模板，无需处理直接加入优化的PCR反 应体系中进行检测，既能减少实验操作步骤，节省时间，同时还避免了开盖操作可能带来的 样本污染。 3)采用本发明的试剂盒和检测样本，通过在荧光定量PCR仪上运行PCR扩增程序， 分析检测结果，根据CT值区分出三个基因多态性。该荧光定量PCR仪器可以采用ABI7500系 列(赛默飞世尔科技公司，麻省，美国)，LighterCycler  480(罗氏，巴塞尔，瑞士)，CFX96(美 国伯乐，加州，美国)，MX3005P(安捷伦科技公司，加州，美国)，Rotor-Gene  Q(QIAGEN,凯杰, 德国)等。 所述扩增程序如下： 第一步骤：95℃，5min，循环1次； 第二步骤：95℃，10s；65℃，30s；循环6次，0.5°touchdown不收集荧光； 第三步骤：95℃，10s；60℃，30s；循环45次，收集荧光。 所述根据CT值区分分型的判断标准如下： 第一：FAM通道有S型扩增曲线且CT值<34；HEX无S型扩增曲线或者有S型扩增曲线 且CT>30,且|CTFAM-CTHEX|>3,TT1-TT3为GG型.XY1-XY3为GG型，XT1为GG型，XT2为CC型。 第二：FAM、HEX通道均有S型扩增曲线且CT值<34，且CTFAM-CTHEX|≤3，TT1-TT3为 AG型，XY1-XY2为AG型，XY3为GT型，XT1为AG型，XT2为AC型。 第三：FAM无S型扩增曲线或者有S型扩增曲线且CT>30，且|CTFAM-CTHEX|>3；HEX通 道有S型扩增曲线且CT值<34,为TT1-TT3为AA型，XY1-XY2为AA型，XY3为TT型，XT1-XT2为AA 型。 附图说明 图1为实施例1的梯度稀释扩增曲线结果图。 图2为实施例1的梯度稀释扩增曲线的Ct值与DNA起始拷贝数的对数关系曲线图。 图3为检测样本TT1反应体系的分型GG型图。 图4为检测样本TT2反应体系的分型AG型图。 图5为检测样本TT3反应体系的分型AG型图。 图6为检测样本XY1反应体系的分型GG型图。 图7为检测样本XY2反应体系的分型AA型图。 图8为检测样本XY3反应体系的分型TT型图。 图9为检测样本XT1反应体系的分型AG型图。 图10为检测样本XT2反应体系的分型CC型图。 10 CN 111549118 A 说　明　书 8/12 页