技术摘要：
本发明公开了一种中药贝母DNA提取试剂，包括核裂解液、CTAB缓冲液和TE Buffer，其中核裂解液包括Tris‑HCl、EDTA、NaCl、PVP‑40、β‑巯基乙醇，与CTAB缓冲液组成相近；本发明DNA提取试剂适用于中药贝母DNA的提取，次生代谢产物去除率高，贝母DNA完整度好；本发明还提 全部
背景技术：
目前，分子生物学技术已被广泛应用于中药材鉴定等方面，其中DNA的提取和纯化 是中药材研究的重要基础，快速有效地大量提取高质量的DNA是是对中药材实施分子标记、 基因文库构建、基因分离以及遗传转化及分子鉴定的重要前提。然而大多数中药材经过加 工处理后，其中所含的DNA可能会受到不同程度的降解，不利于保持DNA的完整性；其次，中 药材含有的次生代谢物很难与DNA分开，会直接影响中药材DNA的提取及后续研究。同种中 药材用不同方法提取的DNA，其纯度和提取效率不尽相同，不同中药材用相同方法提取DNA 的结果也不同。 贝母属为百合科多年生草本植物，大多数种类鳞茎供药用，有清热润肺，止咳祛痰 的功效。该属全世界约有130种，我国有61种(含50个变种，5个变型)，其中具有药用价值的 有20余种，常用药材品种主要为川贝母、平贝母、浙贝母和伊贝母等。贝母属植物种间形状 交叉普遍，由于自然条件和地形多变，给传统形态分类带来很大不便，因此，对贝母DNA的分 子检测成为有效分类的方法之一，而如何有效地提取高质量的贝母DNA是保证快速有效分 子检测的前提和基础。目前，对于提取贝母DNA的方法一般有试剂盒法，CTAB法和SDS法。虽 然试剂盒法操作简便且耗时短，但提取出的DNA完整性有时欠佳。因此，本发明在之前CTAB 法的基础上进行改良，建立一种有效和高质量的贝母总DNA提取方法。
技术实现要素：
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种中药贝母DNA提取试剂，包 括核裂解液、CTAB缓冲液和TE Buffer，适用于中药贝母DNA的提取，次生代谢产物去除率 高，贝母DNA完整度好； 本发明的另一个目的是提供一种中药贝母DNA提取方法，采用上述提取试剂，以已 有的CTAB法为基础，进行提取试剂配方的改进以及提取步骤的优化，能获高纯度、高质量的 贝母总DNA，提取方法简单易控制，污染少。 本发明的目的采用如下技术方案实现： 一种中药贝母DNA提取试剂，包括核裂解液、CTAB缓冲液、TE Buffer，所述核裂解 液包括：1mol/L pH 8.0Tris-HCl 90-110mL、0.5mol/L pH 8.0EDTA 8-12mL、NaCl 13-16g、 PVP-40 18-22g、β-巯基乙醇1.5-2.5ml，ddH2O定容至1000mL。 优选地，所述核裂解液包括：1mol/L pH 8 .0Tris-HCl 100mL、0 .5mol/L pH 8.0EDTA 10mL、NaCl 14.6g、PVP-40 20g、β-巯基乙醇2ml，ddH2O定容至1000mL。 Tris-HCl(pH8.0)主要是提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2 或Mn2 离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使脱氧核糖核蛋白可溶。 进一步地，所述CTAB缓冲液包括：CTAB 28-32g、NaCl 75-85g、0 .5mol/L pH 3 CN 111575273 A 说 明 书 2/6 页 8.0EDTA 35-45mL、1mol/L pH 8.0Tris-HCl 95-105mL、PVP-40 18-22g、β-巯基乙醇1.5- 2.5ml，ddH2O定容至1000mL。 优选地，所述CTAB缓冲液包括：CTAB 30g、NaCl 81 .9g、0.5mol/L pH 8 .0EDTA 40mL、1mol/L pH 8.0Tris-HCl 100mL、PVP-40 20g、β-巯基乙醇1.5-2.5ml，ddH2O定容至 1000mL。 CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形 成复合物，使其分离。 进一步地，所述TE Buffer包括：1M pH8 .0 Tris-HCl Buffer 10mL、0 .5M pH8.0EDTA 2mL，ddH2O定容至1000mL。 本发明的目的之二采用以下技术方案实现： 一种中药贝母DNA提取方法，包括： 核裂解液预处理：将研磨好的贝母粉与核裂解液混合，剧烈振荡后离心，弃上清 液，得到样本裂解液； CTAB缓冲液处理：向样本裂解液中加入CTAB缓冲液，振荡混匀后，进行恒温孵育。 进一步地，所述贝母粉的质量与核裂解液的体积比为(0.9-1.1)：(7.5-8.5)。 所述恒温孵育的条件为：60-70℃金属浴1.2-1.7h。 所述样本裂解液与所述CTAB缓冲液的体积比为(0.8-1.2)：(0.8-1.2)。 优选地，所述恒温孵育的条件为：65℃金属浴1.5h。 相比现有技术，本发明的有益效果在于： 1、本发明中药贝母DNA提取方法在CTAB处理前先进行贝母核裂解预处理，核裂解 液配方与后续的CTAB缓冲液近似，可减少DNA的降解；核裂解液中加入了PVP-40(聚乙烯吡 咯烷酮)和β-巯基乙醇复合作用，在核裂解阶段即进行次生代谢产物的分离，去除效果更 好，更能保持贝母DNA的完整性；CTAB缓冲液中添加PVP-40和β-巯基乙醇复合作用，进一步 去除核酸提取液中的次生代谢产物。其中，PVP-40是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的 络合物，有效去除待提取样本中的多酚，减少DNA中酚的污染，同时它也能和多糖结合，有效 去除多糖；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效防止酚氧化成醌，避免褐变，并使酚更多的与PVP- 40络合，使酚更容易去除。 2、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸 形成复合物；它具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在该条件下，蛋 白质和中性多聚糖仍留在溶液里。该复合物在高盐溶液中(NaCl>0.7mol/L)是可溶的，通过 有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸从中分离出来。 3、本发明中药贝母DNA提取方法进一步优化了处理试剂、处理温度、处理时间等工 艺参数，其中所有温度反应均在恒温金属浴上进行，温度恒定，控温准确、稳定性高并且节 能无噪音，同时还可以避免因可能引入水浴锅的水而导致样品污染的问题。此外，恒温金属 浴还可以设置固定转速的水平转动，无需手动颠倒混匀，使得样本细胞裂解效果更佳。 附图说明 图1为本发明实施例1-2和对比例2提取的DNA的琼脂糖凝胶电泳图； 图2为本发明实施例1-2提取的DNA的PCR扩增产物电泳图。 4 CN 111575273 A 说 明 书 3/6 页
