技术摘要：
本发明属于银离子检测领域，具体涉及一种基于SiO2核酸探针和杂交链信号放大的Ag 检测方法，包括下述步骤：1)DNA探针与SiO2微球的偶联；将氨基化修饰的SiO2微球与DNA探针P1在偶联剂作用下进行偶联，得到SiO2‑P1；2)定量检测Ag ；将SiO2‑P1与DNA探针P2，加入到缓冲液中  全部
背景技术：
银元素是人体的组成物质之一，少量的Ag 是无毒的,但人体摄入过多的Ag 是有害 的，世界卫生组织(WHO)建议饮用水中允许的最大浓度为0.1mg/L(约为  927nM)，美国环境 保护署(EPA)建议最大浓度为0.05mg/L(464nM)。、Ag 的毒害作用主要为以下几点：一、使人 体的蛋白质以及各种酶变性。当过量的Ag 在血液中运输时，由于Ag 可与巯基结合从而使相 应的含巯基酶失效，从而影响人体新陈代谢，严重危害身体健康。二、由于Ag 的强氧化性， 进入人体的Ag 会引起诸如内脏水肿等症状，甚至导致死亡。由于人体没有有效的排银机 制，过多摄入的Ag 会沉积在牙龈、皮肤、肝脏等组织或器官内。并且Ag 中毒目前是没有有效 的解毒剂的，因此，亟需建立一种高选择性、高灵敏度的Ag 识别和检测方法，这对环境监测 以及医疗健康等方面具有重要意义。 传统的Ag 检测方法主要有电感耦合等离子体质谱法、原子吸收光谱法、溶出伏安 法等等。这些方法在特定的时代为Ag 检测做出了巨大的贡献，并且它们由于具有较高的灵 敏度以及稳定的检测手段沿用至今。但是由于这些方法的不可移植性、高昂的仪器成本、复 杂的材料准备以及对专业操作的需要，它们的应用范围也受到了高度限制。因此，我们亟需 一种开发简单、快速、廉价的检测Ag 的方法来弥补传统方法的不足。而近来，人们发现Ag 可 通过配位作用与胞嘧啶特异性结合形成C-Ag -C特殊结构，实现DNA之间的错配，此现象已 经广泛的用于Ag 的检测。而随着科技的进步、生产力的发展，我们有了越来越多的用于检 测微量或者痕量物质的方法和手段，例如比色法、荧光法、电化学分析法等等。这些方法比 起传统方法更加快捷、方便，在灵敏度和特异性上也十分可靠，不需要冗杂的准备阶段以及 昂贵的仪器设施，更加符合当前世界科学实验的需要。 杂交链式反应(hybridizationchainreaction，HCR)是由Pierce和Dirks  在2004 年首次发现并报道的一种无酶等温核酸扩增技术，并且是一个可以在体外进行的核酸扩增 技术，广泛应用于特定DNA序列、蛋白质和小分子等物质的高灵敏度检测。杂交链式反应最 大的优点在于不需要酶的参与，所以不需要像聚合酶链式反应(PCR)一般经历变形、退火、 延伸三步的循环往复，所以很少出现非特异性扩增影响实验的现象，也就极大避免了假阴 性和假阳性结果。杂交链式反应易于控制，整个反应条件也比较温和，仅需一步反应即可迅 速得到扩增的短链DNA。杂交链式反应这一信号扩增技术与各种检测分析方法皆可较好地 搭配。基于上述优势，科研工作者经常利用杂交链式反应提升蛋白、核酸等生物分子以及重 金属、其他小分子检测的灵敏度。与其他核酸链式扩增反应相比较，对于研究人员而言，杂 交链式反应所带来的最大优点是整个过程无酶参与，这为以后的工作带来了极大的便利。 3 CN 111593095 A 说　明　书 2/6 页
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种基于SiO2微球的核酸探针和杂交链信号放大的  Ag 检 测方法。 本发明为实现上述目的，采用以下技术方案： 一种基于SiO2核酸探针以及杂交链信号放大的Ag 检测方法,其特征在于，包括下 述步骤： 1)DNA探针与SiO2微球的偶联；将氨基化修饰的SiO2微球与DNA探针P1在偶联剂作 用下进行偶联，得到SiO2-P1； 2)定量检测Ag ；将SiO2-P1与DNA探针P2，加入到缓冲液中，混匀，然后加入杂交链 反应探针H1和荧光探针Cy5-H2，加入待检测目标Ag ，充分混匀，孵育；在反应完成后，通过 使用离心机离心除去上清液，并将沉淀物重悬于水中，测量Cy5荧光信号强度。 DNA探针P1为：TCAGCCCGGC或者AAAAATCAGCCCGGC；DNA探针P2为：  AGTCTAGGATTCG GCGTGGGTTAAGCCCCCCTGA或者  AGTCTAGGATTCGGCGTGGGTTAAAAAAAGCCCCCCTGA。 所述的缓冲液为柠檬酸钠缓冲溶液。 优选的，步骤2)的具体步骤为：将步骤1)中连接的10μL  DNA-SiO2探针和0.7μL  10 μmol/L  DNA探针P2)加入到25μL柠檬酸钠SSC缓冲液中，充分混匀，然后加入1.5μL的1μM杂 交链反应探针H1和1.5μL的1μmol/L  Cy5-H2；最后，加入目标Ag ，充分混匀，在37℃下孵育 60分钟；在反应完成后，通过使用离心机以11,000rpm离心10分钟，除去上清液，并将沉淀物 重悬于50 μL水中，并通过AzureC600测量Cy5荧光信号强度。 与现有技术相比，本发明的有益效果是： 本发明通过在SiO2微球上偶联核酸杂交信号，开发了一种简单，高效且灵敏的检 测Ag 的方法。由于C-Ag -C结构具有强而特异性的结合相互作用，因此设计了两个末端带有 多个胞嘧啶碱基的DNA探针来检测Ag ，这可以显著提高传感器的特异性。同时，借助于HCR 的无酶等温核酸扩增，通过检测标记在组分  H2上的Cy5的荧光信号，可以实现Ag 的高检测 灵敏度和较大分析范围。最后，我们还验证了传感器的特异性和在实际样品中的检测能力， 并将其与标准的Ag 检测方法ICP-MS进行了比较。基于此设计的传感器可以实现低成本，高 特异性和超灵敏的检测Ag 的能力。本发明首次将C-Ag -C结构与杂交链式反应相结合，可检 测出pM级别的Ag ，实现了Ag 高效、快捷的检测。 附图说明： 图1示出Ag 检测原理图； 图2示出基于SiO2核酸探针和杂交链信号放大的Ag 检测方法灵敏度拟合图； 图3示出制备的基于SiO 2核酸探针和杂交链信号放大的Ag 检测方法条件优化实验 图； 图4示出制备的基于SiO2核酸探针和杂交链信号放大的Ag 检测方法特异性实验 图。