技术摘要：
本发明提供了一种人肝癌组织和肝脏组织活性单细胞悬液的制备方法，包括以下步骤：S1组织样品保存以及转运：S2组织漂洗及预消化；S3组织消化；S4终止消化及过滤除杂；S5裂解红细胞及第二次过滤；S6洗涤纯化细胞：清除坏死细胞；S7重悬获取细胞。由本发明肝脏组织活性单 全部
背景技术：
近年来生物学的研究在单细胞领域取得飞跃的发展和进步。如Cytof质谱流式、BD Rhapsody、10×Genomics等技术平台应运而生。目前最为热门的当属单细胞转录组测序的 研究，它能够在一定程度上详细解析复杂样本中不同类型细胞之间的特定差异，获取到之 前被全转录组测序所掩盖的一些关键数据。此外，单细胞蛋白组的相关研究也在探索中，虽 然目前只能对选定的蛋白组合进行单细胞定量检测，但单细胞蛋白定量同样可以在单细胞 水平得到不同细胞亚型之间的差异情况。然而不论是哪种研究，在进行单细胞相关研究之 前，获得高质量的单细胞悬液是实验成功的第一步，也是实验能够顺利开展的关键一步。单 细胞悬液制备不合格或失败，后续研究便无从谈起。 目前针对肝癌组织和正常肝组织单细胞悬液的制备中存在着较大的方法缺陷和 技术难点，相关文献资料及各生物技术公司对此制备方法虽有描述和介绍，但均难以在实 验中保持稳定及可重复性，且各方介绍的制备方法存在消化时间过长及细胞活性明显不足 等关键技术缺陷。因此，本课题组经反复实验探索及充分验证后建立了一项高效制备人肝 癌组织和人肝脏组织单细胞悬液的关键技术。该项技术属于生物实验制备技术，主要用于 肝脏疾病及肝癌的单细胞相关研究，解决目前对肝脏组织及肝癌组织进行单细胞转录组测 序时单细胞悬液制备成功率较低的关键问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种人肝癌组织和肝脏 组织活性单细胞悬液的制备方法。经本发明的探索及充分验证后研究出一项高效制备肝脏 单细胞悬液的制备方法。该方法主要用于解决对肝脏组织及肝癌组织进行单细胞转录组测 序时单细胞悬液制备成功率较低的问题。 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种人肝癌组织和肝脏组织活性单 细胞悬液的制备方法，包括以下步骤： S1组织样品保存以及转运：将穿刺组织标本离体后快速浸泡入装有预冷培养基的 采样容器中，转运时间不超过20分钟； S2组织漂洗及预消化：将获取的肝组织用无血清培养基漂洗，漂洗后将组织进行 预消化； S3组织消化：将剪碎的肝组织浸泡于培养基中，加入组织消化酶，放入摇床进行震 荡消化； S4终止消化及过滤除杂：在步骤S2的消化液中加入血清和无血清培养基，摇匀，然 后过滤消化液，离心除杂，收集沉淀； 3 CN 111575236 A 说 明 书 2/7 页 S5裂解红细胞及第二次过滤：在步骤S3中的沉淀中加入红细胞裂解液摇匀静置， 将其经过滤器进行过滤，离心； S6洗涤纯化细胞：清除坏死细胞； S7重悬获取细胞：在细胞沉淀中加入预冷PBS重悬细胞。 优选地，在将组织标本浸泡于采样容器之前，还包括以下步骤：准备装有冰块的冰 盒，向采样容器中加入预冷的无血清培养基。本发明实施例中采用的冰盒为长宽高分别约 40cm×30cm×40cm塑料冰盒；在15ml塑料采样杯(或15ml离心管)中加入5-8ml预先存放4℃ 冰箱预冷的无血清培养基DMEM或1640。 优选地，所述培养基为无血清培养基DMEM或1640。 优选地，所述肝组织包括肝癌组织和正常肝组织。 优选地，所述肝组织包括穿刺组织和手术标本组织。 优选地，所述穿刺组织为16G穿刺针留取3条或3条以上穿刺组织。 优选地，所述手术标本组织为切取鲜活组织200-500mg。 优选地，所述步骤S1中预消化的具体步骤为：漂洗完后将组织浸泡在加入消化酶 的培养基孔板中预消化5分钟，间断60秒轻轻摇晃15秒。 优选地，所述步骤S2中消化的具体步骤为：培养基完全浸泡的组织剪碎的肝组织， 再加入消化酶，摇匀1分钟，置于37℃摇床，倾斜45度角放置，摇速180RPM，摇床震荡15分钟。 优选地，所述步骤S4中过滤前用红细胞裂解液预先湿润过滤器，离心条件为：4℃， 450g(约1600rpm)，5分钟，加速度5降速度4。 本发明的有益效果：由本发明肝脏组织活性单细胞悬液的制备方法获得单细胞， 其细胞活性较高，细胞总体活性大于70％，且操作较为简单，稳定性好，适用于单细胞领域 的相关科学实验研究，解决了各实验室及各生物公司在开展肝脏疾病或肝脏肿瘤的科研工 作中制备肝脏单细胞悬液的所遇难题。 附图说明 图1实验器材示意图(其中表示孔板 培养基 消化酶)。 图2实验器材剪刀、镊子、6cm培养皿示意图。 图3实验器40μm过滤器示意图。 图4大块组织剪碎示意图。 图5第一孔漂洗示意图。 图6第二孔漂洗示意图。 图7第三孔预消化示意图。 图8组织处理示意图。 图9震荡消化前管底可见组织示意图。 图10震荡消化摇床参数设置。 图11震荡消化后可见管底组织消失示意图。 图12第一次过滤示意图。 图13离心参数设置。 图14裂解红细胞前可见管底红棕色沉淀细胞示意图。 4 CN 111575236 A 说 明 书 3/7 页 图15裂解红细胞后可见管底淡黄色沉淀细胞示意图。 图16荧光检测结果示意图。 图17台盼蓝检测结果示意图。
本发明提供了一种人肝癌组织和肝脏组织活性单细胞悬液的制备方法，包括以下步骤：S1组织样品保存以及转运：S2组织漂洗及预消化；S3组织消化；S4终止消化及过滤除杂；S5裂解红细胞及第二次过滤；S6洗涤纯化细胞：清除坏死细胞；S7重悬获取细胞。由本发明肝脏组织活性单 全部
背景技术：
近年来生物学的研究在单细胞领域取得飞跃的发展和进步。如Cytof质谱流式、BD Rhapsody、10×Genomics等技术平台应运而生。目前最为热门的当属单细胞转录组测序的 研究，它能够在一定程度上详细解析复杂样本中不同类型细胞之间的特定差异，获取到之 前被全转录组测序所掩盖的一些关键数据。此外，单细胞蛋白组的相关研究也在探索中，虽 然目前只能对选定的蛋白组合进行单细胞定量检测，但单细胞蛋白定量同样可以在单细胞 水平得到不同细胞亚型之间的差异情况。然而不论是哪种研究，在进行单细胞相关研究之 前，获得高质量的单细胞悬液是实验成功的第一步，也是实验能够顺利开展的关键一步。单 细胞悬液制备不合格或失败，后续研究便无从谈起。 目前针对肝癌组织和正常肝组织单细胞悬液的制备中存在着较大的方法缺陷和 技术难点，相关文献资料及各生物技术公司对此制备方法虽有描述和介绍，但均难以在实 验中保持稳定及可重复性，且各方介绍的制备方法存在消化时间过长及细胞活性明显不足 等关键技术缺陷。因此，本课题组经反复实验探索及充分验证后建立了一项高效制备人肝 癌组织和人肝脏组织单细胞悬液的关键技术。该项技术属于生物实验制备技术，主要用于 肝脏疾病及肝癌的单细胞相关研究，解决目前对肝脏组织及肝癌组织进行单细胞转录组测 序时单细胞悬液制备成功率较低的关键问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种人肝癌组织和肝脏 组织活性单细胞悬液的制备方法。经本发明的探索及充分验证后研究出一项高效制备肝脏 单细胞悬液的制备方法。该方法主要用于解决对肝脏组织及肝癌组织进行单细胞转录组测 序时单细胞悬液制备成功率较低的问题。 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种人肝癌组织和肝脏组织活性单 细胞悬液的制备方法，包括以下步骤： S1组织样品保存以及转运：将穿刺组织标本离体后快速浸泡入装有预冷培养基的 采样容器中，转运时间不超过20分钟； S2组织漂洗及预消化：将获取的肝组织用无血清培养基漂洗，漂洗后将组织进行 预消化； S3组织消化：将剪碎的肝组织浸泡于培养基中，加入组织消化酶，放入摇床进行震 荡消化； S4终止消化及过滤除杂：在步骤S2的消化液中加入血清和无血清培养基，摇匀，然 后过滤消化液，离心除杂，收集沉淀； 3 CN 111575236 A 说 明 书 2/7 页 S5裂解红细胞及第二次过滤：在步骤S3中的沉淀中加入红细胞裂解液摇匀静置， 将其经过滤器进行过滤，离心； S6洗涤纯化细胞：清除坏死细胞； S7重悬获取细胞：在细胞沉淀中加入预冷PBS重悬细胞。 优选地，在将组织标本浸泡于采样容器之前，还包括以下步骤：准备装有冰块的冰 盒，向采样容器中加入预冷的无血清培养基。本发明实施例中采用的冰盒为长宽高分别约 40cm×30cm×40cm塑料冰盒；在15ml塑料采样杯(或15ml离心管)中加入5-8ml预先存放4℃ 冰箱预冷的无血清培养基DMEM或1640。 优选地，所述培养基为无血清培养基DMEM或1640。 优选地，所述肝组织包括肝癌组织和正常肝组织。 优选地，所述肝组织包括穿刺组织和手术标本组织。 优选地，所述穿刺组织为16G穿刺针留取3条或3条以上穿刺组织。 优选地，所述手术标本组织为切取鲜活组织200-500mg。 优选地，所述步骤S1中预消化的具体步骤为：漂洗完后将组织浸泡在加入消化酶 的培养基孔板中预消化5分钟，间断60秒轻轻摇晃15秒。 优选地，所述步骤S2中消化的具体步骤为：培养基完全浸泡的组织剪碎的肝组织， 再加入消化酶，摇匀1分钟，置于37℃摇床，倾斜45度角放置，摇速180RPM，摇床震荡15分钟。 优选地，所述步骤S4中过滤前用红细胞裂解液预先湿润过滤器，离心条件为：4℃， 450g(约1600rpm)，5分钟，加速度5降速度4。 本发明的有益效果：由本发明肝脏组织活性单细胞悬液的制备方法获得单细胞， 其细胞活性较高，细胞总体活性大于70％，且操作较为简单，稳定性好，适用于单细胞领域 的相关科学实验研究，解决了各实验室及各生物公司在开展肝脏疾病或肝脏肿瘤的科研工 作中制备肝脏单细胞悬液的所遇难题。 附图说明 图1实验器材示意图(其中表示孔板 培养基 消化酶)。 图2实验器材剪刀、镊子、6cm培养皿示意图。 图3实验器40μm过滤器示意图。 图4大块组织剪碎示意图。 图5第一孔漂洗示意图。 图6第二孔漂洗示意图。 图7第三孔预消化示意图。 图8组织处理示意图。 图9震荡消化前管底可见组织示意图。 图10震荡消化摇床参数设置。 图11震荡消化后可见管底组织消失示意图。 图12第一次过滤示意图。 图13离心参数设置。 图14裂解红细胞前可见管底红棕色沉淀细胞示意图。 4 CN 111575236 A 说 明 书 3/7 页 图15裂解红细胞后可见管底淡黄色沉淀细胞示意图。 图16荧光检测结果示意图。 图17台盼蓝检测结果示意图。
