技术摘要：
本发明公开了一种多价肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗的制备方法，包括多糖‑蛋白偶联物的制备；所述多糖为单价肺炎球菌荚膜多糖；所述蛋白为白喉CRM197蛋白；所述多糖‑蛋白偶联物的具体制备步骤包括：将白喉CRM197蛋白原液调节pH至4.0～7.0，加入活化剂(碳化二亚胺EDC)、偶 全部
背景技术：
肺炎球菌(又称肺炎链球菌)是一种广泛定植于人类鼻咽部，它是引起社区获得性 肺炎的主要因素。肺炎球菌引起的疾病是导致全球5岁以下儿童死亡的重要原因，据估计， 在中国每年有大约3万名5岁以下儿童死于各种肺炎球菌性疾病。在欠发达的中、低经济收 入国家，肺炎球菌在幼儿群体中的定植时间早于发达国家，成人的携带率也明显高于发达 国家，可达到40％；发达国家儿童鼻咽部肺炎球菌携带率为27％，而在发展中国家达到 85％；在欧洲国家和美国，30％～50％成人获得性肺炎是由肺炎球菌引起的。另外，随着肺 炎球菌多重耐药问题的日益严重，肺炎球菌性疾病的临床治疗也愈发困难。因此，接种肺炎 疫苗来抵御肺炎球菌的危害是非常必要的。 肺炎球菌的荚膜多糖可以作为抗原成分，其可以制备成多糖疫苗或者多糖蛋白结 合疫苗。 肺炎球菌多糖疫苗，是以经过纯化的肺炎球菌荚膜多糖作为主要成分制备的疫 苗。把不同血清型的荚膜多糖混合在一起，则制备成多价疫苗。自从上世纪80年代23价肺炎 球菌多糖疫苗问世至今，对于预防肺炎球菌的感染起到了非常积极的作用。但是，这种荚膜 多糖为非T细胞依赖抗原，多糖疫苗存在一定的局限性：免疫原性较弱，不能产生免疫记忆； 过了免疫保护期(一般5年)后，再次接种时，出现免疫抑制，无免疫应答；对于免疫系统处在 发育阶段的婴幼儿免疫原性不足；在某些特定人群中免疫应答会受到影响，如人类免疫缺 陷病毒感染者、恶性血液病患者和骨髓移植者；不能降低鼻咽部肺炎球菌带菌率，而不能防 御黏膜肺炎球菌感染以及耐药肺炎球菌传播。 肺炎球菌结合疫苗，是把免疫原性较弱的荚膜多糖抗原与载体蛋白共价结合后制 备的疫苗。同样，也可以把多种血清型的荚膜多糖蛋白结合物混合在一起，制备成多价结合 疫苗。Wyeth公司的13价结合疫苗Prevenarl3在2010年获批上市，展示出良好的免疫原性。 目前，世界上澳大利亚、日本、美国及一些欧洲国家已经把肺炎球菌结合疫苗纳入计划免疫 中。 最近几年，我国的肺炎疫苗的研制也有较快的进展，但是结合疫苗的研制对技术 要求极高。因此，开发出肺炎球菌结合疫苗具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种多价肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗的制备方法，以解决 肺炎球菌结合疫苗制备工艺中，肺炎球菌荚膜多糖、结合蛋白、多糖蛋白偶联物的制备，并 最终配制成肺炎球菌结合疫苗。 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案： 3 CN 111588842 A 说 明 书 2/6 页 一种多价肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗的制备方法，具体制备步骤包括：多糖-蛋白 偶联物的制备； 所述多糖为单价肺炎球菌荚膜多糖；所述蛋白为白喉CRM197蛋白； 所述多糖-蛋白偶联物的具体制备步骤包括：将白喉CRM197蛋白原液调节pH至4.0 ～7.0，加入活化剂、偶联剂，活化反应后得活化液；再将活化液加入单价肺炎球菌荚膜多糖 原液中，偶联反应后纯化，即完成多糖-蛋白偶联物的制备。 与现有技术相比，本发明的有益效果是： 上述技术方案对肺炎球菌荚膜多糖-白喉CRM197蛋白偶联，在酸性条件下CRM197 上的羧基可被活化，形成活化的中间体，此中间体可以迅速被转化成相对稳定的结构，在碱 性条件下与肺炎荚膜多糖的氨基结合，形成多糖-蛋白偶联物，再经纯化可以去除掉未参与 反应的物质和未结合的成分，即可获得纯偶联物； 采用EDC/sNHS组合进行肺炎荚膜多糖和白喉CRM197蛋白组合的偶联，具有无毒、 细胞相容性好、效率高、反应条件温和、多种离子强度和pH条件下均可反应的优点。
本发明公开了一种多价肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗的制备方法，包括多糖‑蛋白偶联物的制备；所述多糖为单价肺炎球菌荚膜多糖；所述蛋白为白喉CRM197蛋白；所述多糖‑蛋白偶联物的具体制备步骤包括：将白喉CRM197蛋白原液调节pH至4.0～7.0，加入活化剂(碳化二亚胺EDC)、偶 全部
背景技术：
肺炎球菌(又称肺炎链球菌)是一种广泛定植于人类鼻咽部，它是引起社区获得性 肺炎的主要因素。肺炎球菌引起的疾病是导致全球5岁以下儿童死亡的重要原因，据估计， 在中国每年有大约3万名5岁以下儿童死于各种肺炎球菌性疾病。在欠发达的中、低经济收 入国家，肺炎球菌在幼儿群体中的定植时间早于发达国家，成人的携带率也明显高于发达 国家，可达到40％；发达国家儿童鼻咽部肺炎球菌携带率为27％，而在发展中国家达到 85％；在欧洲国家和美国，30％～50％成人获得性肺炎是由肺炎球菌引起的。另外，随着肺 炎球菌多重耐药问题的日益严重，肺炎球菌性疾病的临床治疗也愈发困难。因此，接种肺炎 疫苗来抵御肺炎球菌的危害是非常必要的。 肺炎球菌的荚膜多糖可以作为抗原成分，其可以制备成多糖疫苗或者多糖蛋白结 合疫苗。 肺炎球菌多糖疫苗，是以经过纯化的肺炎球菌荚膜多糖作为主要成分制备的疫 苗。把不同血清型的荚膜多糖混合在一起，则制备成多价疫苗。自从上世纪80年代23价肺炎 球菌多糖疫苗问世至今，对于预防肺炎球菌的感染起到了非常积极的作用。但是，这种荚膜 多糖为非T细胞依赖抗原，多糖疫苗存在一定的局限性：免疫原性较弱，不能产生免疫记忆； 过了免疫保护期(一般5年)后，再次接种时，出现免疫抑制，无免疫应答；对于免疫系统处在 发育阶段的婴幼儿免疫原性不足；在某些特定人群中免疫应答会受到影响，如人类免疫缺 陷病毒感染者、恶性血液病患者和骨髓移植者；不能降低鼻咽部肺炎球菌带菌率，而不能防 御黏膜肺炎球菌感染以及耐药肺炎球菌传播。 肺炎球菌结合疫苗，是把免疫原性较弱的荚膜多糖抗原与载体蛋白共价结合后制 备的疫苗。同样，也可以把多种血清型的荚膜多糖蛋白结合物混合在一起，制备成多价结合 疫苗。Wyeth公司的13价结合疫苗Prevenarl3在2010年获批上市，展示出良好的免疫原性。 目前，世界上澳大利亚、日本、美国及一些欧洲国家已经把肺炎球菌结合疫苗纳入计划免疫 中。 最近几年，我国的肺炎疫苗的研制也有较快的进展，但是结合疫苗的研制对技术 要求极高。因此，开发出肺炎球菌结合疫苗具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种多价肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗的制备方法，以解决 肺炎球菌结合疫苗制备工艺中，肺炎球菌荚膜多糖、结合蛋白、多糖蛋白偶联物的制备，并 最终配制成肺炎球菌结合疫苗。 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案： 3 CN 111588842 A 说 明 书 2/6 页 一种多价肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗的制备方法，具体制备步骤包括：多糖-蛋白 偶联物的制备； 所述多糖为单价肺炎球菌荚膜多糖；所述蛋白为白喉CRM197蛋白； 所述多糖-蛋白偶联物的具体制备步骤包括：将白喉CRM197蛋白原液调节pH至4.0 ～7.0，加入活化剂、偶联剂，活化反应后得活化液；再将活化液加入单价肺炎球菌荚膜多糖 原液中，偶联反应后纯化，即完成多糖-蛋白偶联物的制备。 与现有技术相比，本发明的有益效果是： 上述技术方案对肺炎球菌荚膜多糖-白喉CRM197蛋白偶联，在酸性条件下CRM197 上的羧基可被活化，形成活化的中间体，此中间体可以迅速被转化成相对稳定的结构，在碱 性条件下与肺炎荚膜多糖的氨基结合，形成多糖-蛋白偶联物，再经纯化可以去除掉未参与 反应的物质和未结合的成分，即可获得纯偶联物； 采用EDC/sNHS组合进行肺炎荚膜多糖和白喉CRM197蛋白组合的偶联，具有无毒、 细胞相容性好、效率高、反应条件温和、多种离子强度和pH条件下均可反应的优点。
