技术摘要：
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种可同时检测多种耐药基因的引物探针系统及试剂盒。首先，本发明公开了一种可同时检测多种耐药基因的引物系统，包括核苷酸序列如SEQ ID N0：1‑24所示的核苷酸序列组。还公开了包括该引物系统的试剂盒，以及使用该引物系统或试剂盒 全部
背景技术：
抗菌药物是临床应用最广泛的一类药物，但近年感染性疾病的病死率迅速提升， 究其原因在于抗生素滥用，耐药菌带来的用药困难。我国是抗生素滥用情况最为严重的国 家之一，然而随着抗生素使用量的增加，细菌耐药情况也越发严重。当前，细菌耐药性的监 测/检测重点包括：1、耐甲氧西林的葡萄球菌(MRS)；2、耐万古霉素的多重耐药的肠球菌 (VRE)；3、耐β-内酰胺类和大环内酯类的多重耐药肺炎链球菌(PRSP)；4、产超广谱β内酰胺 酶(ESBLs)及AmpC酶的革兰氏阴性杆菌；5、非发酵糖菌群的多重耐药问题等；6、耐碳青霉烯 类药物的肠杆菌科细菌(CRE)。 超广谱β-内酰胺酶是β-内酰胺酶的一种，能水解包括碳青霉烯类抗生素在内的几 乎所有β-内酰胺类抗生素，而且绝大多数对β-内酰胺酶抑制剂具有抗性。根据编码ESBLs基 因同源性，可将其分为 -TEM型、SHV型、CTX-M型、 OXA型等多个类别，每个类别含有多种亚 型，且每种类别及其亚型水解药物的特性会有所差别。能产生ESBL的细菌即为ESBL( )菌， 主要由大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌等肠杆菌科细菌组成，这类细菌在持续的各种β-内酰 胺类抗菌药物的选择压力下，被诱导产生且能够不断变异的β-内酰胺酶，该β-内酰胺酶扩 展了其耐受头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟等第3代头孢菌素、第4代头孢菌素和氨曲南等单 环β-内酰胺类抗菌药物的能力。 碳青霉烯类抗生素对大多数革兰氏阳性及革兰氏阴性病菌感染均有强大的抗菌 效果，是临床上抵御严重细菌感染的重要屏障。然而随着临床的广泛应用，特别是滥用，产 碳青霉烯类酶(KPC)的肺炎克雷伯菌已经陆续出现，现已有十多种KPC耐药基因，包括 blaKPC-1到blaKPC-19，含有这些耐药基因的微生物将对KPC类抗生素失去敏感性。但是随 着碳青霉烯类抗菌药物的大量使用，国内外开始报道对碳青霉烯类抗菌药物不敏感甚至耐 药的肠杆菌科细菌，这极大地限制了碳青霉烯类抗菌药物的使用，产生这一现象的重要原 因是菌株获得了碳青霉烯酶基因。其中由质粒携带的碳青霉烯酶基因由于其耐药基因环境 存在介导转移的基因元件，使得其易于在不同细菌间转移，造成了碳青霉烯酶耐药性的广 泛传播，如KPC、IMP、VIM、OXA等碳青霉烯酶在肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌及弗劳地枸橼酸杆 菌等已有流行趋势，另有研究报道携带NDM-1型酶肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌表现出了超 强的耐药性。这些耐药酶基因可以通过质粒、整合子等方式，在不同的菌株之间传播，导致 细菌耐药率迅速增加，耐药性也迅速增强，给医院和社区感染性疾病的预防和控制带来很 大困扰，对公众健康也造成日益严重的威胁。 CHINET数据显示，近年来大肠杆菌与肺炎克雷伯菌的ESBL耐药率达到 50％上下， 碳青霉烯类抗生素耐药也在持续攀升。到目前为止，临床耐药菌的检测仍然主要是通过对 标本进行选择性培养计数菌落数后，再通过传统药敏试验检验，传统的微生物培养法和药 3 CN 111593131 A 说 明 书 2/7 页 敏试验法能在临床上提供较好的价值，但因耗时长、繁琐的操作过程、需要昂贵的仪器设备 等不同的原因未能在临床上大规模推广使用，因而研发一种简便、快速的多种耐药基因联 合检测方法具有极大的应用前景。 随着分子生物学的发展，分子生物学技术在微生物领域的应用，特别是荧光定量 PCR和数字PCR检测技术平台的出现后，越来越广泛。数字PCR技术是在qPCR技术上发展起来 的第三代PCR技术，理论上可以实现对单个拷贝的目标核酸片段进行扩增检测，是当前灵敏 度最高的核酸检测技术。利用多色荧光数字PCR平台，结合不同荧光标记水解探针的应用， 可以同时对多个目标片段进行检测。 然而如何将数字PCR技术有效的应用于多种耐药基因的检测仍是本领域技术人员 亟需克服的难题。
技术实现要素：
本发明针对耐甲氧西林的葡萄球菌mecA基因、超广谱β-内酰胺酶比较常见和重要 的CTX-M-14、CTX-M-15、和碳青霉烯酶基因blaKPC、NDM进行联合检测，对中国人群进行筛 查，能有效地起到准确诊断、耐药溯源、耐药控制等作用，从而减少抗生素使用量，降低耐药 产生，在科研领域和临床上具有极高的应用价值。 具体的，本发明的技术方案如下： 一种可同时检测多种耐药基因的引物探针系统，包括： 用于检测CTX-M-14基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：1、 SEQ ID N0：2和SEQ ID N0：3所示； 用于检测CTX-M-15基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：4、 SEQ ID N0：5和SEQ ID N0：6所示； 用于检测mecA基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：7-10和 SEQ ID N0：11-12所示； 用于检测NDM基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：13-16 和SEQ ID N0：17-18所示； 用于检测blaKPC基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0： 19-22和 SEQ ID N0：23-24所示。 应当理解，与上述核苷酸序列具有90％以上(例如92％、94％、96％或98％等)同源 性且功能相同的核苷酸序列变体，均在本发明的保护范围之内。 CTX-M-14基因为超广谱β内酰胺酶CTX-M-14型基因；CTX-M-15基因为超广谱β内酰 胺酶CTX-M-15型基因。mecA基因为甲氧西林耐药基因(青霉素结合蛋白PBP2a的结构基因)。 blaKPC基因为碳青霉烯酶基因。NDM基因编码新德里金属β-内酰胺酶。 本发明第二个方面公开了上述的引物探针系统制备的可同时检测多种耐药基因 的产品。 进一步的，所述产品为试剂盒。 更进一步的，所述试剂盒包括检测试剂。 本发明还公开了一种同时检测多种耐药基因的方法，所述方法使用上述的引物系 统或上述的产品进行检测。 4 CN 111593131 A 说 明 书 3/7 页 进一步的，基于多重数字PCR平台进行检测。 术语“多重数字PCR”是指在同一数字PCR反应体系里加上两对或两对以上引物，同 时扩增出多个核酸片段的数字PCR反应。将多重PCR技术与数字PCR技术有机结合而形成的 多重数字PCR，根据DNA探针不同荧光度、DNA扩增不同循环数及多种标记荧光同时使用，便 可大幅提高数字PCR多重性，多重性可达 20-50以上，即同时在一个PCR反应单元内进行20- 50个以上的数字PCR反应。 进一步的，上述方法包括以下步骤： (1)提取样本核酸； (2)配置数字PCR反应液； (3)制备液滴芯片； (4)运行液滴芯片扩增程序后，采用生物芯片阅读仪进行分析后报告输出。 需要强调的是，根据本发明的教导，本领域技术人员有能力选择合适的方法，而不 限于如上描述的方案。 进一步的，检测样品为感染患者血浆样品。通过常规试剂盒提取临床样品血浆中 的游离核酸，并用液滴数字PCR系统进行检测。 进一步的，所述扩增程序包括：95℃预变性5min；95℃变性15秒，60℃退火 30秒， 循环40次。 本发明还公开了上述的引物探针系统、上述的产品或上述的方法在临床领域中的 应用。 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构 思与保护范围。 本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果： 1 .本发明采用多色多重的检测方案，将多种目标基因联合检测，单位时间和反应 孔内同时获得多个耐药基因的检测结果。 2.本发明的检测方法和检测试剂盒，可快速、准确及超高灵敏度地检测5种细菌耐 药基因，根据目标耐药基因的定量/半定量检测结果，可实时、快速监测血流感染患者体内 的特定耐药基因的变化，及时评估患者状况，为临床医生提供辅助治疗建议。
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种可同时检测多种耐药基因的引物探针系统及试剂盒。首先，本发明公开了一种可同时检测多种耐药基因的引物系统，包括核苷酸序列如SEQ ID N0：1‑24所示的核苷酸序列组。还公开了包括该引物系统的试剂盒，以及使用该引物系统或试剂盒 全部
背景技术：
抗菌药物是临床应用最广泛的一类药物，但近年感染性疾病的病死率迅速提升， 究其原因在于抗生素滥用，耐药菌带来的用药困难。我国是抗生素滥用情况最为严重的国 家之一，然而随着抗生素使用量的增加，细菌耐药情况也越发严重。当前，细菌耐药性的监 测/检测重点包括：1、耐甲氧西林的葡萄球菌(MRS)；2、耐万古霉素的多重耐药的肠球菌 (VRE)；3、耐β-内酰胺类和大环内酯类的多重耐药肺炎链球菌(PRSP)；4、产超广谱β内酰胺 酶(ESBLs)及AmpC酶的革兰氏阴性杆菌；5、非发酵糖菌群的多重耐药问题等；6、耐碳青霉烯 类药物的肠杆菌科细菌(CRE)。 超广谱β-内酰胺酶是β-内酰胺酶的一种，能水解包括碳青霉烯类抗生素在内的几 乎所有β-内酰胺类抗生素，而且绝大多数对β-内酰胺酶抑制剂具有抗性。根据编码ESBLs基 因同源性，可将其分为 -TEM型、SHV型、CTX-M型、 OXA型等多个类别，每个类别含有多种亚 型，且每种类别及其亚型水解药物的特性会有所差别。能产生ESBL的细菌即为ESBL( )菌， 主要由大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌等肠杆菌科细菌组成，这类细菌在持续的各种β-内酰 胺类抗菌药物的选择压力下，被诱导产生且能够不断变异的β-内酰胺酶，该β-内酰胺酶扩 展了其耐受头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟等第3代头孢菌素、第4代头孢菌素和氨曲南等单 环β-内酰胺类抗菌药物的能力。 碳青霉烯类抗生素对大多数革兰氏阳性及革兰氏阴性病菌感染均有强大的抗菌 效果，是临床上抵御严重细菌感染的重要屏障。然而随着临床的广泛应用，特别是滥用，产 碳青霉烯类酶(KPC)的肺炎克雷伯菌已经陆续出现，现已有十多种KPC耐药基因，包括 blaKPC-1到blaKPC-19，含有这些耐药基因的微生物将对KPC类抗生素失去敏感性。但是随 着碳青霉烯类抗菌药物的大量使用，国内外开始报道对碳青霉烯类抗菌药物不敏感甚至耐 药的肠杆菌科细菌，这极大地限制了碳青霉烯类抗菌药物的使用，产生这一现象的重要原 因是菌株获得了碳青霉烯酶基因。其中由质粒携带的碳青霉烯酶基因由于其耐药基因环境 存在介导转移的基因元件，使得其易于在不同细菌间转移，造成了碳青霉烯酶耐药性的广 泛传播，如KPC、IMP、VIM、OXA等碳青霉烯酶在肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌及弗劳地枸橼酸杆 菌等已有流行趋势，另有研究报道携带NDM-1型酶肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌表现出了超 强的耐药性。这些耐药酶基因可以通过质粒、整合子等方式，在不同的菌株之间传播，导致 细菌耐药率迅速增加，耐药性也迅速增强，给医院和社区感染性疾病的预防和控制带来很 大困扰，对公众健康也造成日益严重的威胁。 CHINET数据显示，近年来大肠杆菌与肺炎克雷伯菌的ESBL耐药率达到 50％上下， 碳青霉烯类抗生素耐药也在持续攀升。到目前为止，临床耐药菌的检测仍然主要是通过对 标本进行选择性培养计数菌落数后，再通过传统药敏试验检验，传统的微生物培养法和药 3 CN 111593131 A 说 明 书 2/7 页 敏试验法能在临床上提供较好的价值，但因耗时长、繁琐的操作过程、需要昂贵的仪器设备 等不同的原因未能在临床上大规模推广使用，因而研发一种简便、快速的多种耐药基因联 合检测方法具有极大的应用前景。 随着分子生物学的发展，分子生物学技术在微生物领域的应用，特别是荧光定量 PCR和数字PCR检测技术平台的出现后，越来越广泛。数字PCR技术是在qPCR技术上发展起来 的第三代PCR技术，理论上可以实现对单个拷贝的目标核酸片段进行扩增检测，是当前灵敏 度最高的核酸检测技术。利用多色荧光数字PCR平台，结合不同荧光标记水解探针的应用， 可以同时对多个目标片段进行检测。 然而如何将数字PCR技术有效的应用于多种耐药基因的检测仍是本领域技术人员 亟需克服的难题。
技术实现要素：
本发明针对耐甲氧西林的葡萄球菌mecA基因、超广谱β-内酰胺酶比较常见和重要 的CTX-M-14、CTX-M-15、和碳青霉烯酶基因blaKPC、NDM进行联合检测，对中国人群进行筛 查，能有效地起到准确诊断、耐药溯源、耐药控制等作用，从而减少抗生素使用量，降低耐药 产生，在科研领域和临床上具有极高的应用价值。 具体的，本发明的技术方案如下： 一种可同时检测多种耐药基因的引物探针系统，包括： 用于检测CTX-M-14基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：1、 SEQ ID N0：2和SEQ ID N0：3所示； 用于检测CTX-M-15基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：4、 SEQ ID N0：5和SEQ ID N0：6所示； 用于检测mecA基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：7-10和 SEQ ID N0：11-12所示； 用于检测NDM基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：13-16 和SEQ ID N0：17-18所示； 用于检测blaKPC基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0： 19-22和 SEQ ID N0：23-24所示。 应当理解，与上述核苷酸序列具有90％以上(例如92％、94％、96％或98％等)同源 性且功能相同的核苷酸序列变体，均在本发明的保护范围之内。 CTX-M-14基因为超广谱β内酰胺酶CTX-M-14型基因；CTX-M-15基因为超广谱β内酰 胺酶CTX-M-15型基因。mecA基因为甲氧西林耐药基因(青霉素结合蛋白PBP2a的结构基因)。 blaKPC基因为碳青霉烯酶基因。NDM基因编码新德里金属β-内酰胺酶。 本发明第二个方面公开了上述的引物探针系统制备的可同时检测多种耐药基因 的产品。 进一步的，所述产品为试剂盒。 更进一步的，所述试剂盒包括检测试剂。 本发明还公开了一种同时检测多种耐药基因的方法，所述方法使用上述的引物系 统或上述的产品进行检测。 4 CN 111593131 A 说 明 书 3/7 页 进一步的，基于多重数字PCR平台进行检测。 术语“多重数字PCR”是指在同一数字PCR反应体系里加上两对或两对以上引物，同 时扩增出多个核酸片段的数字PCR反应。将多重PCR技术与数字PCR技术有机结合而形成的 多重数字PCR，根据DNA探针不同荧光度、DNA扩增不同循环数及多种标记荧光同时使用，便 可大幅提高数字PCR多重性，多重性可达 20-50以上，即同时在一个PCR反应单元内进行20- 50个以上的数字PCR反应。 进一步的，上述方法包括以下步骤： (1)提取样本核酸； (2)配置数字PCR反应液； (3)制备液滴芯片； (4)运行液滴芯片扩增程序后，采用生物芯片阅读仪进行分析后报告输出。 需要强调的是，根据本发明的教导，本领域技术人员有能力选择合适的方法，而不 限于如上描述的方案。 进一步的，检测样品为感染患者血浆样品。通过常规试剂盒提取临床样品血浆中 的游离核酸，并用液滴数字PCR系统进行检测。 进一步的，所述扩增程序包括：95℃预变性5min；95℃变性15秒，60℃退火 30秒， 循环40次。 本发明还公开了上述的引物探针系统、上述的产品或上述的方法在临床领域中的 应用。 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构 思与保护范围。 本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果： 1 .本发明采用多色多重的检测方案，将多种目标基因联合检测，单位时间和反应 孔内同时获得多个耐药基因的检测结果。 2.本发明的检测方法和检测试剂盒，可快速、准确及超高灵敏度地检测5种细菌耐 药基因，根据目标耐药基因的定量/半定量检测结果，可实时、快速监测血流感染患者体内 的特定耐药基因的变化，及时评估患者状况，为临床医生提供辅助治疗建议。
