技术摘要：
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种利用高通量测序进行基因分型的方法、试剂盒及应用。本发明构建了一套类似试剂盒的通用barcode片段，使得以更低的成本，更快的速度进行基因型鉴定。本发明将barocde与二代测序相结合开发的新型鉴定基因型技术对于SNP和InDel的鉴定  全部
背景技术：
高通量测序技术(High-throughput  sequencing)又称“下一代”测序技术("Next- generation"sequencing  technology)，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序 列测定和一般读长较短等为标志。高通量测序技术一般由样品准备、文库构建、测序反应和 数据分析四部分组成，这就使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可 能，所以又被称为深度测序(deep  sequencing)。利用高通量测序技术进行SNP分型的方法 有：GBS(Genotyping-by-sequencing ,通过简化基因组基于二代测序进行基因分型技术) (Elshire  et  al.2011)、AmpSeq(amplicon  sequencing，通过扩增子测序的低成本基因分 型技术)(Yang  et  al .2016)、HD-Marker(基于高通量测序的GoldenGate方法)(Lv  et  al.2018)等。传统的利用测序技术进行基因分型的方法通常会遭受数据丢失率高和错误率 高的困扰，特别是在低读取深度下来自杂合基因座和稀有等位基因的检测会产生较高的错 误率，且成本高昂。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种利用高通量测序进行基因分型的方 法、试剂盒及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部 分问题。本发明的直接目的是非诊断目的地进行基因分型，且仅依据本发明中的检测方法 的检测结果无法得出疾病的诊断结果。 本发明是这样实现的，一种利用高通量测序进行基因分型的方法，其特征在于，包 括以下步骤： 构建通用Barcode片段，包括前引物和后引物，所述前引物中包括bridge片段及 Barcode1片段，所述后引物中包括Barcode2片段及reverse  primer片段；以黄色荧光蛋白 YFP片段DNA为模板，利用所述前引物和后引物进行PCR扩增YFP  DNA，得到Barcode片段； 针对待测SNP位点设计一对普通引物，其中前引物距离SNP位点在150bp内或者后 引物距离SNP位点在36bp内，且后引物需要在其5’端加上bridge片段；以样品DNA为模板，利 用设计的引物进行SNP片段扩增； 将各样品对应的上述扩增的Ba rcod e片段和SNP片段做混合模板，进行 overlapping  PCR扩增，获得用于测序的完整片段；所用正向引物为SNP位点的前引物，所用 反向引物为reverse片段的反向互补序列； 将获得的待测序片段混合后进行纯化； 纯化后的产品建库并进行二代测序； 数据分析，得出基因分型结果。 4 CN 111549107 A 说　明　书 2/9 页 针对384个待测样本设计24种包含不同Barcode1序列的前引物以及16种包含不同 Barcode2序列的后引物；涉及的前引物序列见SEQ  ID  NO.1-SEQ  ID  NO.24所示；涉及的16 种后引物序列见SEQ  ID  NO.25-SEQ  ID  NO.40所示；对待测样本检测时，由前引物和后引物 组成不同的引物对。 进一步地，进行SNP片段扩增的PCR体系中，如果检测1个SNP位点的基因型，则引物 F和R分别加入0.8ul；检测2个SNP位点的基因型，则引物F和R分别混合后各加入1ul；检测5 个SNP位点的基因型，引物F和R分别混合后各加入2ul；检测20个SNP位点的基因型，引物F和 R分别混合后各加入3ul。 进一步地，进行overlapping  PCR扩增的PCR体系中，如果检测1个SNP位点，则引物 F加入0.8μl；2个SNP位点则引物Fmix加入1.2μl；5个SNP位点则引物Fmix加入1.5μl；20个SNP 位点则引物Fmix加入2μl；反向引物EndR所加量均为0.8μl。 进一步地，所述纯化包括磁珠纯化。 如上述的一种利用高通量测序进行基因分型的方法在基因分型、基因定位或绘制 遗传图谱中的应用。 一种利用高通量测序进行基因分型的试剂盒，包括通用Barcode片段，具体包括前 引物和后引物，所述前引物中包括bridge片段及Barcode1片段，所述后引物中包括 Barcode2片段及reverse片段；2X  Phanta  Master  Mix，2X  Taq  Plus  Master  Mix。 进一步地，所述前引物见SEQ  ID  NO.1-SEQ  ID  NO.24所示，所述后引物序列见SEQ  ID  NO.25-SEQ  ID  NO.40所示；对待测样本检测时，由前引物和后引物组成不同的引物对， 所述试剂盒可组成384个不同的引物对。 进一步地，所述试剂盒的检测方法如权利要求1-5任一所述。 如上述的一种利用高通量测序进行基因分型的试剂盒在基因分型、基因定位或绘 制遗传图谱中的应用。 综上所述，本发明的优点及积极效果为： 本发明利用分子条码(Barcode)以及二代测序开发了一种新的高通量标记技术， 可以快速高效低成本地对SNP基因型进行鉴定。 本技术构建的一套类似试剂盒的通用barcode片段，使得以更低的成本，更快的速 度进行基因型鉴定。本发明将barocde与二代测序相结合开发的新型鉴定基因型技术对于 SNP和InDel的鉴定是十分高效且简单的，同时所需成本远远低于市面价格，尤其是对大批 量样品的鉴定此优点更加突出。另外这种技术也可以应用于基因定位以及绘制遗传图谱 等，因此它的应用范围也十分广泛。 附图说明 图1是本发明的方法原理图； 图2是20个位点扩增的PCR检测； 图3是不同测序深度下位点密度图； 图4是不同测序深度下SNP位点准确率箱线图。 5 CN 111549107 A 说　明　书 3/9 页