技术摘要：
本发明提供了一种牛体外受精胚胎或牛克隆胚胎的培养液以及培养方法，属于牛体外胚胎的培养技术领域；所述牛体外胚胎的培养液，包括胚胎基础培养液和瘦素；所述瘦素在培养液中的浓度为1～80ng/ml。本发明所述培养方法，包括以下步骤：1细胞到8细胞期的牛体外受精胚胎或 全部
背景技术：
与体内胚胎相比，牛活体采卵技术是20世纪90年代发展起来的一项新型胚胎生产 技术。该技术弥补了传统体外受精技术的缺陷，可获得大量遗传系谱明确的胚胎。相对于超 数排卵/胚胎移植(Multiple Ovulation Embryo Transfer–MOET)技术来说，活体采卵/体 外受精(Ovum Pick Up/InVitro Fertilization-OPU/IVF)技术具有许多优势。0PU/IVF技 术可以使每头牛在有限的时间内产生大量后代。因为OPU/IVF技术不依赖于供体牛的繁殖 状态；人们可以通过非手术方式从出生三个月龄以上的犊牛，育成牛，成年牛，老龄牛，怀孕 三个月以内的牛；超排不起作用的牛身上采集卵母细胞。另外，对一次采集的卵母细胞可以 用不同公牛的精液进行体外受精。而在MOET育种体系中只能使用一头种公牛进行受精，因 而OPU/IVF能够获得最大的遗传进展和最小的近交系数。OPU/IVF技术在体外受精时可选用 性控精液，从而可以选择后代性别。收集的高质量的卵母可用于动物克隆和转基因等研究 项目。 目前，这两种技术已经成为欧美和大洋洲等畜牧业发达国家的农场主为扩大良种 母牛群而采用的重要繁殖技术。然而，采用常规的牛胚胎培养体系(SOF液)，牛体外受精的 囊胚发育率较低，而且胚胎质量也远不及体内胚胎，导致胚胎移植受体后的妊娠率低，因此 如何提高囊胚发育率及胚胎质量成为体外受精胚胎生产的重点和研究的焦点。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种专用于牛体外受精胚胎或牛克隆胚胎的培 养液和培养方法；所述培养液和培养方法能够显著提高囊胚发育率及胚胎质量，缩短囊胚 期形成时间，降低体外生产胚胎的成本。 为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案： 本发明提供了一种牛体外受精胚胎或牛克隆胚胎的培养液，包括胚胎基础培养液 和瘦素；所述瘦素在培养液中的浓度为1～80ng/ml。 优选的，所述瘦素在培养液中的浓度为5～12ng/ml。 优选的，所述瘦素在培养液中的浓度为10ng/ml。 优选的，所述胚胎基础培养液为合成输卵管液SOF。 优选的，所述合成输卵管液SOF，以水为溶剂，包括以下浓度的组分：NaC1 99 .7mmol/L，KC1 7 .16mmol/L，NaHCO3 25 .07mmol/L，MgC12·6H2O 0 .49mmol/L，KH2PO4 1.19mmol/L，丙酮酸钠0.4mmol/L，乳酸钠3.3mmol/L，体积分数5％的胎牛血清，CaC12·6H2O 1.71mmol/L，体积分数1％的必需氨基酸和体积分数1％的非必须氨基酸。 本发明提供了一种牛体外受精胚胎或牛克隆胚胎的培养方法，包括以下步骤：将 3 CN 111593020 A 说 明 书 2/5 页 牛体外受精胚胎或牛克隆胚胎置于所述的牛体外受精胚胎或牛克隆胚胎培养液中，在38.5 ℃，0.5％CO2、100％湿度条件下进行体外培养。 优选的，所述牛体外受精胚胎或牛克隆胚胎为1细胞期～8细胞期胚胎。 优选的，所述体外培养的时间为4～7天。 优选的，所述牛体外受精胚胎或牛克隆胚胎培养液的用量为0.08～0.12ng/每一 枚胚胎。 本发明的有益效果：本发明提供的牛体外受精胚胎或牛克隆胚胎的培养液，包括 胚胎基础培养液和瘦素；所述瘦素的添加能够显著提高体外发育系统的囊胚发育率。根据 实施例记载，利用本发明所述的培养液培养的体外受精胚胎囊胚率为36％；比对照组 (22％)提高14％。本发明提供的培养液能够缩短囊胚形成的时间，有60％的囊胚出现在胚 胎培养的第六天，而对照组只有40％的囊胚出现在胚胎培养的第六天。最佳剂量瘦素 (10ng/ml)培养液，显著提高胚胎质量，胚胎细胞从对照组的128增加到160，胚胎移植结果 进一步证实了本发明所述的培养液的有效性，受胎率从38.7％提高到56％。 利用本发明所述的培养液对牛克隆胚胎的培养同样有效，囊胚率为36％比对照组 (55％)提高19％；胚胎细胞从对照组的169增加到208。
本发明提供了一种牛体外受精胚胎或牛克隆胚胎的培养液以及培养方法，属于牛体外胚胎的培养技术领域；所述牛体外胚胎的培养液，包括胚胎基础培养液和瘦素；所述瘦素在培养液中的浓度为1～80ng/ml。本发明所述培养方法，包括以下步骤：1细胞到8细胞期的牛体外受精胚胎或 全部
背景技术：
与体内胚胎相比，牛活体采卵技术是20世纪90年代发展起来的一项新型胚胎生产 技术。该技术弥补了传统体外受精技术的缺陷，可获得大量遗传系谱明确的胚胎。相对于超 数排卵/胚胎移植(Multiple Ovulation Embryo Transfer–MOET)技术来说，活体采卵/体 外受精(Ovum Pick Up/InVitro Fertilization-OPU/IVF)技术具有许多优势。0PU/IVF技 术可以使每头牛在有限的时间内产生大量后代。因为OPU/IVF技术不依赖于供体牛的繁殖 状态；人们可以通过非手术方式从出生三个月龄以上的犊牛，育成牛，成年牛，老龄牛，怀孕 三个月以内的牛；超排不起作用的牛身上采集卵母细胞。另外，对一次采集的卵母细胞可以 用不同公牛的精液进行体外受精。而在MOET育种体系中只能使用一头种公牛进行受精，因 而OPU/IVF能够获得最大的遗传进展和最小的近交系数。OPU/IVF技术在体外受精时可选用 性控精液，从而可以选择后代性别。收集的高质量的卵母可用于动物克隆和转基因等研究 项目。 目前，这两种技术已经成为欧美和大洋洲等畜牧业发达国家的农场主为扩大良种 母牛群而采用的重要繁殖技术。然而，采用常规的牛胚胎培养体系(SOF液)，牛体外受精的 囊胚发育率较低，而且胚胎质量也远不及体内胚胎，导致胚胎移植受体后的妊娠率低，因此 如何提高囊胚发育率及胚胎质量成为体外受精胚胎生产的重点和研究的焦点。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种专用于牛体外受精胚胎或牛克隆胚胎的培 养液和培养方法；所述培养液和培养方法能够显著提高囊胚发育率及胚胎质量，缩短囊胚 期形成时间，降低体外生产胚胎的成本。 为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案： 本发明提供了一种牛体外受精胚胎或牛克隆胚胎的培养液，包括胚胎基础培养液 和瘦素；所述瘦素在培养液中的浓度为1～80ng/ml。 优选的，所述瘦素在培养液中的浓度为5～12ng/ml。 优选的，所述瘦素在培养液中的浓度为10ng/ml。 优选的，所述胚胎基础培养液为合成输卵管液SOF。 优选的，所述合成输卵管液SOF，以水为溶剂，包括以下浓度的组分：NaC1 99 .7mmol/L，KC1 7 .16mmol/L，NaHCO3 25 .07mmol/L，MgC12·6H2O 0 .49mmol/L，KH2PO4 1.19mmol/L，丙酮酸钠0.4mmol/L，乳酸钠3.3mmol/L，体积分数5％的胎牛血清，CaC12·6H2O 1.71mmol/L，体积分数1％的必需氨基酸和体积分数1％的非必须氨基酸。 本发明提供了一种牛体外受精胚胎或牛克隆胚胎的培养方法，包括以下步骤：将 3 CN 111593020 A 说 明 书 2/5 页 牛体外受精胚胎或牛克隆胚胎置于所述的牛体外受精胚胎或牛克隆胚胎培养液中，在38.5 ℃，0.5％CO2、100％湿度条件下进行体外培养。 优选的，所述牛体外受精胚胎或牛克隆胚胎为1细胞期～8细胞期胚胎。 优选的，所述体外培养的时间为4～7天。 优选的，所述牛体外受精胚胎或牛克隆胚胎培养液的用量为0.08～0.12ng/每一 枚胚胎。 本发明的有益效果：本发明提供的牛体外受精胚胎或牛克隆胚胎的培养液，包括 胚胎基础培养液和瘦素；所述瘦素的添加能够显著提高体外发育系统的囊胚发育率。根据 实施例记载，利用本发明所述的培养液培养的体外受精胚胎囊胚率为36％；比对照组 (22％)提高14％。本发明提供的培养液能够缩短囊胚形成的时间，有60％的囊胚出现在胚 胎培养的第六天，而对照组只有40％的囊胚出现在胚胎培养的第六天。最佳剂量瘦素 (10ng/ml)培养液，显著提高胚胎质量，胚胎细胞从对照组的128增加到160，胚胎移植结果 进一步证实了本发明所述的培养液的有效性，受胎率从38.7％提高到56％。 利用本发明所述的培养液对牛克隆胚胎的培养同样有效，囊胚率为36％比对照组 (55％)提高19％；胚胎细胞从对照组的169增加到208。
