技术摘要：
本申请涉及一种在昆虫细胞中共表达非洲猪瘟病毒四种结构蛋白的方法及其应用。本发明将非洲猪瘟病毒四种结构蛋白pp62、p54、p30和p72基因插入经改造pFastBac‑Dual后获得的穿梭载体，制备重组穿梭质粒pF4‑pp62‑p54‑p30‑p72，并获得重组杆状病毒rBac‑pp62‑p54‑p30  全部
背景技术：
非洲猪瘟(African  Swine  Fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African  Swine  Fever  Virus，ASFV)感染引起的猪的一种烈性、高度接触性传染病。其急性症状以高热、网状内皮 系统出血及高死亡率为特征。家猪和野猪所有品种及各年龄段均易感。钝缘蜱属软蜱，特别 是O.moubata和O.erraticus是非洲猪瘟病毒的贮存媒介和传播媒介。此前该病仅限于非洲 发生，直到上世纪中叶传到欧洲、南美及加勒比海地区，2007年传入东欧并逐渐蔓延至俄罗 斯西伯利亚地区。2018年8月3日，我国确诊首例非洲猪瘟疫情，随后该病在全国大范围爆 发，并给我国养猪业带来巨大损害。 非洲猪瘟病毒属于DNA病毒，病毒粒子呈正二十面体结构。其基因组DNA包含151～ 167个开放阅读框，约编码68种结构蛋白和100多种非结构蛋白。其中，pp62、p54、p30和p72 四种蛋白为非洲猪瘟病毒重要的结构蛋白，在非洲猪瘟病毒的组装和侵染宿主细胞中有着 极其重要的作用，也是目前非洲猪瘟病毒致病机制、疫苗研制以及检测方法的主要靶蛋白。 目前，虽然现有技术中有对于上述四种蛋白的分别表达或个别进行部分共表达， 但至今未见有在昆虫细胞中同时共表达非洲猪瘟病毒pp62、p54、p30和p72四种蛋白的方法 和体系。而鉴于非洲猪瘟病毒属于高致病烈性猪传染病病毒，我国法定一类传染病病毒，按 照生物安全管理要求，除农村农业部认可的实验室外，其他实验室不得操作涉及非洲猪瘟 病毒分离等实验。因此，寻求多种结构蛋白一次性共表达作为病毒替代，能够为在无法进行 非洲猪瘟病毒操作的情况下提供了一种制备其高效抗原的新的研究途径和方法，具有极其 重要意义。 鉴于此，提出本发明。
技术实现要素：
本申请的目的之一是提供了一种含pF4-pp62-p54-p30-p72的重组杆状病毒的构 建方法，用该重组杆状病毒感染昆虫细胞Sf9后可同时表达非洲猪瘟病毒pp62、p30、p54和 p72四种结构蛋白； 本申请的目的之二是提供了一种应用，利用重组杆状病毒同时表达来制备pp62、 p30、p54和p72四种重组蛋白； 本申请的目的之三是提供了一种间接ELISA方法，以共表达的pp62、p30、p54和p72 四种混合重组蛋白为包被抗原，建立了一种用于非洲猪瘟抗体检测的间接ELISA方法； 为实现上述目的，本发明提供了一种重组穿梭质粒pF4，其具有4个多克隆位点； 在一些实施方式中，所述质粒pF4为载体pFastBac-Dual的第3510位碱基与第3985 4 CN 111593072 A 说　明　书 2/10 页 位碱基之间的序列被F4序列代替，从而具有4个含有独立启动子的多克隆位点MCS1、MCS2、 MCS3、MCS4。 在一些优选的实施方式中，所述F4的基因序列如SEQ  ID  NO.1所示；优选的，所述 重组穿梭质粒pF4的基因序列如SEQ  ID  NO.6所示。 本申请还提供了一种插入了非洲猪瘟病毒四种结构蛋白pp62、p30、p54和p72基因 的重组穿梭质粒的pF4-pp62-p54-p30-p72，所述质粒是将非洲猪瘟病毒四种结构蛋白 pp62、p54、p30和p72基因插入所述的重组穿梭质粒pF4中。 在一些实施方式中，所述非洲猪瘟病毒pp62基因插入pF4多克隆位点MCS3的酶切 位点Sph  I和Xho  I之间；p54基因插入表达载体pF4多克隆位点MCS1的酶切位点Sbf  I和Nhe  I之间；p30基因插入表达载体pF4多克隆位点MCS2的酶切位点Aat  II和Eco81  I之间；p72基 因插入表达载体pF4多克隆位点MCS4的酶切位点BamH  I和EcoR  I之间。 在一些实施方式中，所述pp62、p54、p30和p72基因序列分别如SEQ  ID  NO .2-5所 示。 本发明还提供了一种重组病毒，其特征在于，包含上述所述重组穿梭质粒，或通过 转入或转座上述所述重组穿梭质粒； 在一些优选的实施方式中，所述重组病毒为重组杆状病毒rBac-pp62-p54-p30- p72。 本申请还提供了一种上述重组表达质粒或病毒的构建方法，包括以下步骤： 1)限制性内切酶Bsp1407  I和SnaB  I对质粒pUC–F4和载体pFastBac-Dual进行双 酶切，切胶回收纯化获得线性的F4和pFastBac-Dual；通过连接、转化、PCR和双酶切等技术 获得重组穿梭质粒pF4； 2)限制性内切酶Sbf  I和Nhe  I对质粒pUC–pp62和重组穿梭质粒pF4进行双酶切， 胶回收纯化酶切产物，获得线性的pp62和pF4；通过连接、转化、PCR和双酶切等技术获得重 组穿梭质粒pF4-pp62； 3)限制性内切酶Sph  I和Xho  I对质粒pUC–p54和重组穿梭质粒pF4-pp62进行双酶 切，胶回收纯化酶切产物，获得线性的p54和pF4-pp62；通过连接、转化、PCR和双酶切等技术 获得重组穿梭质粒pF4-pp62-p54； 4)限制性内切酶Aat  II和Eco81I对质粒pUC–p30和重组穿梭质粒pF4-pp62-p54进 行双酶切，胶回收纯化获得线性的p30和pF4-pp62-p54；通过连接、转化、PCR和双酶切等技 术获得重组穿梭质粒pF4-pp62-p54-p30； 5)限制性内切酶BamH  I和EcoR  I对质粒pUC–p72和重组穿梭质粒pF4-pp62-p54- p30进行双酶切，切胶获得线性的p72和pF4-pp62-p54-p30；通过连接、转化、PCR和双酶切等 技术获得重组穿梭质粒pF4-pp62-p54-p30-72； 6)将重组穿梭质粒pF4-pp62-p54-p30-72以热激方式转化入感受态细胞DH10Bac， 通过菌落PCR筛选出转座成功的重组杆粒。通过脂质体转染昆虫细胞Sf9，从而获得重组杆 状病毒rBac-pp62-p54-p30-72。 本申请还提供一种利用上述重组杆状病毒感染昆虫细胞Sf9后共表达非洲猪瘟病 毒pp62、p54、p30、p72蛋白的方法，包括以下步骤： 1)将上述重组杆状病毒接种至Sf9细胞，27℃培养72h； 5 CN 111593072 A 说　明　书 3/10 页 2)待80％Sf9细胞出现细胞病变，加入RIPA裂解液裂解细胞； 3)4℃，10000r/min离心10min，离心后，采用Ni亲和层析柱纯化上清中的目的蛋， 从而获得纯化的非洲猪瘟病毒pp62、p30、p54和p72蛋白混合物。 本申请还提供了一种制备检测非洲猪瘟抗体的间接ELISA试剂盒的方法，所述方 法包括利用上述重组质粒共表达非洲猪瘟病毒pp62、p54、p30和p72蛋白，纯化得混合重组 蛋白，以混合重组蛋白作为包被抗原制备ELISA试剂盒；优选的，所述混合重组蛋白的加入 量为0.25μg/孔。 本申请还提供了一种以共表达纯化的pp62、p30、p54和p72四种混合重组蛋白为包 被抗原建立的用于检测非洲猪瘟抗体的间接ELISA方法，优选的，所述混合重组蛋白的加入 量为0.25μg/孔。 在一些实施方式中，上述方法具体包括以下步骤： (1)包被用碳酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH  9.6)包被液稀释纯化的混合重组蛋白， 加入到酶标板中，每孔蛋白0.25μg，过夜包被； (2)封闭PBST洗涤3次后，加入200μL/孔Protein-Free  T20(PBS)Blocking  Buffer 室温封闭1h； (3)血清样品孵育PBST洗涤3次后，加入PBST稀释后的待检血清样品(最佳稀释倍 数为1/20)100μL/孔，37℃孵育30min； (4)HRP标记的兔抗猪IgG孵育PBST洗涤3次后，加入20，000倍稀释的HRP标记的兔 抗猪IgG，100μL/孔，室温孵育45min； (5)显色与终止PBST洗涤3次后，加入TMB底物液，100μL/孔，室温避光显色10min。 加入终止液50μL/孔，终止显色； (6)读数与结果判定酶标仪读取OD450。样品OD450值≥0.226判为阳性，即非洲猪 瘟阳性血清；OD450值≤0.213，则为非洲猪瘟阴性血清。0.226＜OD450＜0.213判为可疑，需 通过再一次实验进行判定。 本发明还提供了一种所述的重组穿梭质粒或重组病毒在共表达非洲猪瘟病毒 pp62、p30、p54和p72蛋白中的应用。 本发明还提供一种所述重组穿梭质粒或所述重组病毒在建立检测非洲猪瘟病毒 抗体的间接ELISA方法中的应用，其特征在于，利用上述的重组穿梭质粒或重组病毒共表达 非洲猪瘟病毒pp62、p54、p30和p72蛋白，纯化得混合重组蛋白，以混合重组蛋白作为包被抗 原制备ELISA试剂盒。 本发明具有以下优点： (1)本发明获得一种全新的具有四个多克隆位点的重组质粒pF4，为共表达多种蛋 白提供了有效可靠途径。基于该重组质粒构建的重组质粒pF4-pp62-p54-p30-p72，能够在 昆虫细胞中可溶性共表达pp62、p30、p54和p72，且表达量高，适于下游应用。 (2)鉴于非洲猪瘟病毒属于高致病烈性猪传染病病毒，我国法定一类传染病病毒， 按照生物安全管理要求，除农村农业部认可的实验室外，其他实验室不得操作涉及非洲猪 瘟病毒分离等实验。所以，利用本发明技术可在昆虫细胞中一次性高效共表达非洲猪瘟病 毒pp62、p30、p54和p72四种结构蛋白，在无法进行非洲猪瘟病毒操作的情况下，提供了一种 制备其高效抗原的新的研究途径和方法，在该方面具有显著意义。 6 CN 111593072 A 说　明　书 4/10 页 (3)本发明以表达纯化后的非洲猪瘟病毒四种混合重组蛋白直接作为包被抗原， 建立的用于检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA方法，不仅简易便捷性，节省成本，同时混 合蛋白包被能够显著提高非洲猪瘟病毒抗体检出率。 (4)本发明建立的用于检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA方法，具有良好的特异 性、高敏感和重复性，为非洲猪瘟病毒抗体检测提供了一种新的检测技术。 附图说明 图1为本申请的实验技术流程图。 图2为合成序列F4结构图。 图3为改造获得的载体pF4结构图。 图4为改造获得的重组载体pF4-pp62-p54-p30-p72结构图，其中， f1  origin:碱基102-557 Ampicillin抗性基因:碱基689-1549 pUC  origin:碱基1694-2367 Tn7R:碱基2611-2835 Gentamicin抗性基因:碱基2902-3435(complementary  strand) HSV  tkpolyadenylation  signal: (1)碱基3992-4274(complementary  strand) (2)碱基4913-5195(complementary  strand) 多克隆位点: (1)碱基4275-4322(包含：SbfI(SdaI)，NcoI，NheI，EheI) (1)碱基5196-5258(与原载体相同) p10启动子(Pp10): (1)碱基4323-4444(complementary  strand) (2)碱基5259-5380(complementary  strand) Polyhedrin启动子(PPH): (1)碱基4463-4591 (1)碱基5399-5527 多克隆位点: (1)碱基4592-4652(包含：AatII，Eco81I) (2)碱基5528-5642(与原载体相同) SV40  polyadenylation  signal: (1)碱基4653-4893 (2)碱基5643-5883 Tn7L:碱基5913-6077。 图5为重组质粒pF4-pp62-p54-p30-p72的构建鉴定结果，其中， A为pF4-pp62构建结果， B为pF4-pp62-p54构建结果， C为pF4-pp62-p54-p30构建结果， 7 CN 111593072 A 说　明　书 5/10 页 D为pF4-pp62-p54-p30-p72构建结果 图6为细胞病变结果，其中， A为正常Sf9细胞； B为转染后72h的病变Sf9细胞。 图7为间接免疫荧光结果，其中 A为野生杆状病毒感染的Sf9细胞； B为重组杆状病毒rBac-PP62-P54-P30-P72感染的Sf9细胞 图8为纯化产物SDS-PAGE电泳结果，其中 1为纯化产物； 2为重组杆状病毒rBac-PP62-P54-P30-P72感染的Sf9细胞全蛋白； 3为野生杆状病毒感染的Sf9细胞全蛋白； 4为蛋白Marker。 图9为纯化产物Western  blot结果，其中， M为蛋白Marker； 1为野生杆状病毒感染的Sf9细胞全蛋白； 2为纯化产物。 图10为间接ELISA方法特异性试验结果。 图11为间接ELISA方法敏感性试验结果。