技术摘要：
本发明提供一种促进黄酮类物质积累的黄芪毛状根的培养方法，具体包括黄芪无菌苗的培育、发根农杆菌的活化、黄芪外植体与农杆菌的共培养，以及除菌诱导培养和扩大培养。为了促进黄酮类物质的在黄芪毛状根中的积累，本发明选择合适的发根农杆菌对黄芪幼苗进行侵染，在培 全部
背景技术：
黄芪属于豆科多年生草本植物，以根入药，迄今已有2000多年的历史。黄芪的主要 药理作用有补气固表、利尿、托毒排脓、生肌等疗效，主治气短、虚脱、心悸、自汗、体虚浮肿、 慢性肾炎、脱水、久泻、气虚、气血不足、中气下陷，有抗菌消炎、降压利尿、解毒利胆等功效， 是一种常用中草药。 毛状根培养是20世纪80年代发展起来的基因工程和细胞工程相结合的一项技术， 它是将发根农杆菌的Ri质粒中含有的T-DNA整合到植物细胞的DNA上，诱导植物细胞产生毛 状根。毛状根培养相对于细胞培养具有遗传和生物化学方面的稳定性，毛状根可以在不含 激素的培养基上快速生长并可以大量积累经济价值较高的次生代谢产物。因此，毛状根被 认为是极好的获得植物次生代谢产物的原材料。近年来毛状根培养被认为是获得有用次生 代谢产物的重要途径。如何在培养过程中提高毛状根中有用次生代谢产物的积累能力成为 人们关注的焦点 自从1997年Ackermann第一次利用发根农杆菌成功转化高等植物以来，至今已建 立了超过100种植物毛状根的培养系统，其中有不少是药用植物。例如黄花烟草、曼陀罗、颠 茄、莨菪、长春花、紫草、辣根的毛状根小规模培养已经成功。利用毛状根培养技术大规模生 产药用植物的有效次生代谢产物呈现出十分诱人的前景，同时对于保护野生资源与生态环 境，实现可持续发展也具有积极的意义。 因此，本发明希望进一步改进黄芪毛状根的诱导培养方法，以提高毛状根的诱导 效率和促进黄酮类物质的积累，有效的解决黄芪自然资源的缺乏和市场产品紧缺的问题。
技术实现要素：
本发明的目的是克服黄芪自然资源的缺乏和相关市场产品紧缺的问题，利用生物 技术来保护我们珍贵的土壤资源，提供一种促进黄酮类物质积累的黄芪毛状根的培养方 法，通过对黄芪毛状根培养工艺的优化，以及添加合适的诱导因子，促进黄酮类物质在毛状 根中的积累，制备高黄酮含量的黄芪毛状根。 为了实现上述目的，本发明提供一种促进黄酮类物质积累的黄芪毛状根的培养方 法，包括以下步骤： 步骤1.制备黄芪无菌苗 将黄芪种子用自来水浸泡20-24h后，放入70％乙醇中浸泡10-15min，用无菌水冲 洗3-5遍；倒入1％升汞溶液浸泡8-10min；用无菌水冲洗3-5遍；接种至提前灭菌的MS培养基 上，温度15-25℃，湿度50-60％培养，获得黄芪无菌苗； 步骤2.菌种活化和培养 4 CN 111587785 A 说 明 书 2/7 页 将发根农杆菌加入到液体YEB培养基中于26-28℃，220-250rpm下培养至OD600值 为0.5-0.6；然后，将菌液在1/2MS液体培养基中进行培养，于26-28℃下150-180rpm培养20- 30min； 步骤3.材料预培养 将步骤1中黄芪无菌苗的子叶，茎，下胚轴、叶柄切成大小0.4-0.5cm2的小块作为 外植体接种至添加0.1-0.3mg/L植物激素的MS培养基上，避光培养24-48h，； 步骤4.外植体和发根农杆菌的共培养 将步骤3中的外植体与步骤2中的菌液于50-60rpm，25-28℃条件下充分接触10- 15min后；用无菌滤纸吸干表面多余的菌液，接种到添加0.2-0.4mg/L的诱导因子的MS培养 基中培养2-4天；所述诱导因子是CuCl2、AgNO3、CdSe量子点、CdTe量子点的一种或两种以 上； 步骤5.毛状根的除菌诱导培养 将步骤4的外植体用无菌水冲洗后接种到含500mg/L的头孢噻肟钠(cef)的1/2MS 固体培养基上于25℃下避光培养；并间隔一周更换新的培养基，同时逐渐降低头孢噻肟钠 (cef)的浓度； 待根长度达到3cm后将其分离出来，放于含有50mg/L的头孢噻肟钠(cef)和0.6- 0.8mg/L的茉莉酸甲酯的1/2MS固体培养基上，并间隔一周继代一次，继代三次后，将其放于 无头孢噻肟钠(cef)的1/2MS固体培养基上培养； 步骤6.毛状根扩大培养 将步骤5的毛状根转入6,7-V液体培养基中，于25-28℃，100-130rpm下进行扩大培 养，培养过程中施加蓝光，每天光照8-12h，并且每18-20天继代一次，获得大量生长的黄芪 毛状根。 进一步，所述黄芪种子选自蒙古黄芪种子，或膜荚黄芪种子的一种； 进一步，所述MS培养基的每升的组成如下： 大量元素：KNO3 4-6mM，Ca(NO3)2·4H2O 4-6mM，MgSO4·7H2O 1.5-2.5mM，KH2PO4 0.8-1.2mM， 微量元素：H3BO3 44-48μM，MnCl2·4H2O 8-10μM，ZnSO4·7H2O 0 .6-0 .8μM， CuSO4·5H2O 0.2-0.4μM，Na2MoO4·2H2O 0.1-0.3μM，EDTA-Fe-Na 40-60μM； 有机物质：肌醇80-100μM，蔗糖300-450μM，水解酪蛋白300-500μM。 进一步，所述1/2MS培养基的组成是将MS培养基中的大量元素的用量减半；所述1/ 2MS固体培养基中含有2-4％的琼脂。 进一步，所述农杆菌菌株选自ATCC15834，ATCC11325，ACCC10060，LBA9402，R1000， R1601，A4的一种。 进一步，所述步骤2中的液体YEB培养基的组成如下：：取酵母粉1g,牛肉膏5g,蛋白 胨5g,蔗糖5g，MgSO4·7H2O 0.5g溶于1L蒸馏水中，用氢氧化钠调至pH值为7.4，121℃，高压 灭菌20min； 进一步，所述步骤3中的植物激素为IBA、NAA的一种。 进一步，所述步骤6中的6,7-V液体培养基的组成和制备方法如下： A.制备组分母液 5 CN 111587785 A 说 明 书 3/7 页 (1)大量元素母液：每升母液含有16g KNO3、2g(NH4)2SO4、5g MgSO4·7H2O、3g NaH2PO4、4g KCl、0.4g Na2HPO4； (2)CaCl2母液：每升母液含有4g CaCl2·2H2O (3)微量元素母液：每升母液含有4g MnSO4·H2O、1.5g ZnSO4·7H2O、5g H3BO3、 0.05g KI、0.25g NaMoO4·2H2O、0.25g CuSO4·5H2O、0.25g CoCl2·6H2O (4)铁盐母液：每升母液含有1.86g EDTA-Na2、1.39g FeSO4·7H2O (5)维生素母液：每升母液含有0.125g烟酸、0.05g维生素B1、0.05g维生素B6、10g 肌醇 B.所述6,7-V液体培养基的制备方法是：取大量元素母液50mL、CaCl2母液50mL、微 量元素母液1mL、铁盐母液10mL、维生素母液10mL、蔗糖30g；溶于1L蒸馏水调节PH值到5.8。 进一步，所述步骤4中逐步降低头孢噻肟钠(cef)的浓度是按照400mg/L、300mg/L、 200mg/L、100mg/L的方式进行。 本发明具有以下的有益效果： 本发明为了促进黄酮类物质的在黄芪毛状根中的积累，选择合适的发根农杆菌对 黄芪幼苗进行侵染，在培养的不同阶段施加不同的诱导因子协同促进黄酮类物质的积累。 具体而言，在共培养阶段施加诱导因子CuCl2、AgNO3、CdSe量子点、CdTe量子点能够促进黄 芪毛状根的大量、快速增长，刺激黄芪次生代谢过程，提高黄酮类物质的积累；在毛状根的 除菌培养过程中施加茉莉酸甲酯也能够刺激黄芪次生代谢过程，提高黄酮类物质的积累； 以及在扩大培养阶段施加蓝光，也能提高黄酮类物质的积累。总之，本发明通过对黄芪毛状 根培养工艺的调整，获得了黄酮类物质大量积累的黄芪毛状根，有效的解决黄芪自然资源 的缺乏和市场产品紧缺的问题。
本发明提供一种促进黄酮类物质积累的黄芪毛状根的培养方法，具体包括黄芪无菌苗的培育、发根农杆菌的活化、黄芪外植体与农杆菌的共培养，以及除菌诱导培养和扩大培养。为了促进黄酮类物质的在黄芪毛状根中的积累，本发明选择合适的发根农杆菌对黄芪幼苗进行侵染，在培 全部
背景技术：
黄芪属于豆科多年生草本植物，以根入药，迄今已有2000多年的历史。黄芪的主要 药理作用有补气固表、利尿、托毒排脓、生肌等疗效，主治气短、虚脱、心悸、自汗、体虚浮肿、 慢性肾炎、脱水、久泻、气虚、气血不足、中气下陷，有抗菌消炎、降压利尿、解毒利胆等功效， 是一种常用中草药。 毛状根培养是20世纪80年代发展起来的基因工程和细胞工程相结合的一项技术， 它是将发根农杆菌的Ri质粒中含有的T-DNA整合到植物细胞的DNA上，诱导植物细胞产生毛 状根。毛状根培养相对于细胞培养具有遗传和生物化学方面的稳定性，毛状根可以在不含 激素的培养基上快速生长并可以大量积累经济价值较高的次生代谢产物。因此，毛状根被 认为是极好的获得植物次生代谢产物的原材料。近年来毛状根培养被认为是获得有用次生 代谢产物的重要途径。如何在培养过程中提高毛状根中有用次生代谢产物的积累能力成为 人们关注的焦点 自从1997年Ackermann第一次利用发根农杆菌成功转化高等植物以来，至今已建 立了超过100种植物毛状根的培养系统，其中有不少是药用植物。例如黄花烟草、曼陀罗、颠 茄、莨菪、长春花、紫草、辣根的毛状根小规模培养已经成功。利用毛状根培养技术大规模生 产药用植物的有效次生代谢产物呈现出十分诱人的前景，同时对于保护野生资源与生态环 境，实现可持续发展也具有积极的意义。 因此，本发明希望进一步改进黄芪毛状根的诱导培养方法，以提高毛状根的诱导 效率和促进黄酮类物质的积累，有效的解决黄芪自然资源的缺乏和市场产品紧缺的问题。
技术实现要素：
本发明的目的是克服黄芪自然资源的缺乏和相关市场产品紧缺的问题，利用生物 技术来保护我们珍贵的土壤资源，提供一种促进黄酮类物质积累的黄芪毛状根的培养方 法，通过对黄芪毛状根培养工艺的优化，以及添加合适的诱导因子，促进黄酮类物质在毛状 根中的积累，制备高黄酮含量的黄芪毛状根。 为了实现上述目的，本发明提供一种促进黄酮类物质积累的黄芪毛状根的培养方 法，包括以下步骤： 步骤1.制备黄芪无菌苗 将黄芪种子用自来水浸泡20-24h后，放入70％乙醇中浸泡10-15min，用无菌水冲 洗3-5遍；倒入1％升汞溶液浸泡8-10min；用无菌水冲洗3-5遍；接种至提前灭菌的MS培养基 上，温度15-25℃，湿度50-60％培养，获得黄芪无菌苗； 步骤2.菌种活化和培养 4 CN 111587785 A 说 明 书 2/7 页 将发根农杆菌加入到液体YEB培养基中于26-28℃，220-250rpm下培养至OD600值 为0.5-0.6；然后，将菌液在1/2MS液体培养基中进行培养，于26-28℃下150-180rpm培养20- 30min； 步骤3.材料预培养 将步骤1中黄芪无菌苗的子叶，茎，下胚轴、叶柄切成大小0.4-0.5cm2的小块作为 外植体接种至添加0.1-0.3mg/L植物激素的MS培养基上，避光培养24-48h，； 步骤4.外植体和发根农杆菌的共培养 将步骤3中的外植体与步骤2中的菌液于50-60rpm，25-28℃条件下充分接触10- 15min后；用无菌滤纸吸干表面多余的菌液，接种到添加0.2-0.4mg/L的诱导因子的MS培养 基中培养2-4天；所述诱导因子是CuCl2、AgNO3、CdSe量子点、CdTe量子点的一种或两种以 上； 步骤5.毛状根的除菌诱导培养 将步骤4的外植体用无菌水冲洗后接种到含500mg/L的头孢噻肟钠(cef)的1/2MS 固体培养基上于25℃下避光培养；并间隔一周更换新的培养基，同时逐渐降低头孢噻肟钠 (cef)的浓度； 待根长度达到3cm后将其分离出来，放于含有50mg/L的头孢噻肟钠(cef)和0.6- 0.8mg/L的茉莉酸甲酯的1/2MS固体培养基上，并间隔一周继代一次，继代三次后，将其放于 无头孢噻肟钠(cef)的1/2MS固体培养基上培养； 步骤6.毛状根扩大培养 将步骤5的毛状根转入6,7-V液体培养基中，于25-28℃，100-130rpm下进行扩大培 养，培养过程中施加蓝光，每天光照8-12h，并且每18-20天继代一次，获得大量生长的黄芪 毛状根。 进一步，所述黄芪种子选自蒙古黄芪种子，或膜荚黄芪种子的一种； 进一步，所述MS培养基的每升的组成如下： 大量元素：KNO3 4-6mM，Ca(NO3)2·4H2O 4-6mM，MgSO4·7H2O 1.5-2.5mM，KH2PO4 0.8-1.2mM， 微量元素：H3BO3 44-48μM，MnCl2·4H2O 8-10μM，ZnSO4·7H2O 0 .6-0 .8μM， CuSO4·5H2O 0.2-0.4μM，Na2MoO4·2H2O 0.1-0.3μM，EDTA-Fe-Na 40-60μM； 有机物质：肌醇80-100μM，蔗糖300-450μM，水解酪蛋白300-500μM。 进一步，所述1/2MS培养基的组成是将MS培养基中的大量元素的用量减半；所述1/ 2MS固体培养基中含有2-4％的琼脂。 进一步，所述农杆菌菌株选自ATCC15834，ATCC11325，ACCC10060，LBA9402，R1000， R1601，A4的一种。 进一步，所述步骤2中的液体YEB培养基的组成如下：：取酵母粉1g,牛肉膏5g,蛋白 胨5g,蔗糖5g，MgSO4·7H2O 0.5g溶于1L蒸馏水中，用氢氧化钠调至pH值为7.4，121℃，高压 灭菌20min； 进一步，所述步骤3中的植物激素为IBA、NAA的一种。 进一步，所述步骤6中的6,7-V液体培养基的组成和制备方法如下： A.制备组分母液 5 CN 111587785 A 说 明 书 3/7 页 (1)大量元素母液：每升母液含有16g KNO3、2g(NH4)2SO4、5g MgSO4·7H2O、3g NaH2PO4、4g KCl、0.4g Na2HPO4； (2)CaCl2母液：每升母液含有4g CaCl2·2H2O (3)微量元素母液：每升母液含有4g MnSO4·H2O、1.5g ZnSO4·7H2O、5g H3BO3、 0.05g KI、0.25g NaMoO4·2H2O、0.25g CuSO4·5H2O、0.25g CoCl2·6H2O (4)铁盐母液：每升母液含有1.86g EDTA-Na2、1.39g FeSO4·7H2O (5)维生素母液：每升母液含有0.125g烟酸、0.05g维生素B1、0.05g维生素B6、10g 肌醇 B.所述6,7-V液体培养基的制备方法是：取大量元素母液50mL、CaCl2母液50mL、微 量元素母液1mL、铁盐母液10mL、维生素母液10mL、蔗糖30g；溶于1L蒸馏水调节PH值到5.8。 进一步，所述步骤4中逐步降低头孢噻肟钠(cef)的浓度是按照400mg/L、300mg/L、 200mg/L、100mg/L的方式进行。 本发明具有以下的有益效果： 本发明为了促进黄酮类物质的在黄芪毛状根中的积累，选择合适的发根农杆菌对 黄芪幼苗进行侵染，在培养的不同阶段施加不同的诱导因子协同促进黄酮类物质的积累。 具体而言，在共培养阶段施加诱导因子CuCl2、AgNO3、CdSe量子点、CdTe量子点能够促进黄 芪毛状根的大量、快速增长，刺激黄芪次生代谢过程，提高黄酮类物质的积累；在毛状根的 除菌培养过程中施加茉莉酸甲酯也能够刺激黄芪次生代谢过程，提高黄酮类物质的积累； 以及在扩大培养阶段施加蓝光，也能提高黄酮类物质的积累。总之，本发明通过对黄芪毛状 根培养工艺的调整，获得了黄酮类物质大量积累的黄芪毛状根，有效的解决黄芪自然资源 的缺乏和市场产品紧缺的问题。
