技术摘要：
本发明提供一种β‑烟酰胺单核苷酸的工艺制备方法，以四乙酰核糖和烟酸胺或烟酸乙酯为起始物料，经缩合、氨解、化学拆分和磷酸化等主要工艺步骤，通过优化工艺方法，制备得到β‑烟酰胺单核苷酸，本发明基于β‑烟酰胺单核苷酸的质量控制、安全性、制备工艺的工业化批  全部
背景技术：
为了解决现有技术中β-烟酰胺单核苷酸工业化批量生产可行性、制备得到β-烟酰 胺单核苷酸的质量安全可控性和β-烟酰胺单核苷酸的结构鉴定的技术问题，本发明提供一 种β-烟酰胺单核苷酸的工艺制备方法，包括包括以下步骤： S1、缩合：以四乙酰核糖、烟酸胺或烟酸乙酯做为起始物料，在溶剂中经催化剂作 用进行缩合反应得到含有烟酸乙酯三乙酰核苷或烟酰胺三乙酰核苷的溶液； S2、氨解和脱保护：将步骤S1中含有烟酸乙酯三乙酰核苷的溶液先通入氨气进行 氨解，再加入有机碱脱去乙酰基，含有烟酰胺三乙酰核苷的溶液直接加入有机碱脱去乙酰 基，反应结束后经处理得到中间体烟酰胺核糖； S3、化学拆分：中间体烟酰胺核糖为消旋体，在溶剂中经化学试剂拆分、重结晶、除 盐后得到β-烟酰胺核糖； S4、磷酸化：将步骤S3中经拆分得到的β-烟酰胺核糖在溶剂中经三氯氧磷磷酸化 后，先经有机溶剂萃取除杂，除杂后的水层再过离子交换树脂除盐，最后水溶液冻干得到β- 烟酰胺单核苷酸。 进一步的，所述步骤S1中： a)催化剂为TMSCl、TMSBr、TMsOTf中的任意一种； b)物料摩尔比，四乙酰核糖：烟酸胺或烟酸乙酯：催化剂为1：1：0.1～1：1.1：0.1； c)反应溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃、乙腈中任意一种； d)溶剂与四乙酰核糖的体积质量比为3～5ml/g； e)缩合反应温度为0℃～25℃，催化剂加入温度为0℃～5℃； f)缩合反应时间以TLC监控四乙酰核糖消失为止，为12h～14h。 进一步的，反应结束后，控温0℃～5℃加入0.2～0.3当量的三乙胺用于完成破坏 催化剂的淬灭反应。 进一步的，所述步骤S2中： a)烟酸乙酯三乙酰核苷氨解温度为-5℃～5℃，氨解时间以TLC监控烟酸乙酯三乙 酰核苷消失为止，为1h～1.5h； b)脱保护的有机碱为乙醇钠或甲醇钠的中任意一种，溶剂为乙醇或甲醇，溶解后 加入反应液中，溶剂与有机碱的体积质量比为10ml/g； c)烟酸乙酯三乙酰核苷和烟酰胺三乙酰核苷与有机碱的摩尔比均为1：2～1：3； d)烟酸乙酯三乙酰核苷和烟酰胺三乙酰核苷脱保护反应温度为-5℃～5℃； e)烟酸乙酯三乙酰核苷脱保护反应时间以TLC监控烟酸乙酯三乙酰核苷消失为 止，为1h～1.5h；烟酰胺三乙酰核苷脱保护反应时间以TLC监控烟酰胺三乙酰核苷消失为 止，为1h～2h。 进一步的，反应完，反应液中先加入1mol/L盐酸淬灭多余的有机碱，控制pH为5～ 6 CN 111548383 A 说　明　书 4/10 页 6，再加入甲基叔丁基醚、异丙醇和叔丁醇中任意一种搅拌析晶，析晶温度为-5℃～5℃。 进一步的，所述步骤S3中： a)化学试剂为(S)-(-)-alpha-甲苄基异氰酸酯； b)烟酰胺核糖与拆分化学试剂(S)-(-)-alpha-甲苄基异氰酸酯摩尔比为1：1～1： 1.5； c)溶剂为甲醇与水的混合溶剂，甲醇与水体积比为2：1～1：1，溶剂与烟酰胺核糖 的体积质量比为10ml/g； d)拆分条件：加热回流后冷却析晶，重复此操作3～4次。 进一步的，得到的β-烟酰胺核糖的(S)-(-)-alpha-甲苄基异氰酸酯盐用甲醇与水 的混合溶剂再重结晶一次后，将其加入乙酸乙酯或二氯甲烷中，并加入1mol/L的氢氧化钠 水溶液，剧烈搅拌后，除去有机层，水层采用离子交换树脂除盐后再冻干得β-烟酰胺核糖。 进一步的，所述步骤S4中： a)β-烟酰胺核糖与三氯氧磷的摩尔比为1：1.5～1：2； b)溶剂为四氢呋喃和乙腈中的任意一种； c)溶剂与β-烟酰胺核糖的体积质量比为5～6ml/g； d)反应温度为0℃～25℃，三氯氧磷加入温度为0℃～5℃； e)反应时间以HPLC监控β-烟酰胺核糖消失为止，为12h～16h。 进一步的，反应后处理，控制温度为-5℃～5℃，将反应液缓慢倒入常温水中先淬 灭三氯氧磷，再将反应析出的固体用水溶解，加入乙酸乙酯，搅拌，除去乙酸乙酯层，水层采 用离子交换树脂除盐后冻干得到β-烟酰胺单核苷酸。 本发明的有益效果是： 1、本发明以四乙酰核糖和烟酸胺或烟酸乙酯为起始物料，经缩合、脱乙酰保护基 (氨解)、化学拆分和磷酸化等主要工艺步骤，通过优化工艺方法，提供了一种β-烟酰胺单核 苷酸(NMN)工业化批量生产的制备方法； 2、本发明在原有工艺路线基础上做出改进，对所选物料和试剂、物料量的控制等 方面做出优化，相对于原有制备工艺，使其具有操作简单、易工艺放大、收率较高、最终产品 质量可控和安全性可控等的优点，具体包括： (1)、化学拆分：脱保护后得到的中间体烟酰胺核糖为消旋体，需要进行拆分以得 到单一构型的中间体和最终产品，原有工艺大都采用活性炭柱色谱分离或干脆不进行拆 分，这导致成本极高、规模较小或不能应用于医疗治疗领域，本发明采用化学试剂进行拆 分，提供了一种工业化批量生产的制备方法。 (2)、杂质控制：催化剂为三氟甲磺酸酯属于基因毒性杂质，基因毒性杂质属于药 物应用中需要严格控制的杂质类型： a)三氟甲磺酸酯用量控制在0.1当量； b)缩合反应完后采用一定量的三乙胺淬灭三氟甲磺酸酯； c)经多步处理(如重结晶、有机溶剂萃取、水溶液过离子交换树脂等操作)。 经以上优化后三氟甲磺酸酯残留到β-烟酰胺单核苷酸(NMN)中的可能性极低。 (3)、溶剂残留：溶剂选用避免一类高风险溶剂1,2-二氯乙烷和基因毒性杂质溶剂 1,4-二氧六环等： 7 CN 111548383 A 说　明　书 5/10 页 a)溶剂选用乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、甲醇和乙醇等； b)重结晶溶剂选用甲基叔丁基醚、异丙醇和叔丁醇； c)拆分后得到的β-烟酰胺核糖和磷酸化后得到的β-烟酰胺单核苷酸(NMN)经处理 后都存在于水溶液中，经离子交换树脂除盐后直接冻干，不涉及有机溶剂残留。 3、本发明对得到的β-烟酰胺单核苷酸(NMN)进行结构鉴定，并对谱图进行解析，确 保得到的产品与β-烟酰胺单核苷酸的化学结构相符，结构正确。 a)氢谱与氢氢相关谱，主要包括：1HNMR、HCOSY、NOESY； b)碳谱与碳氢相关谱，主要包括：13CNMR、DEPT135、HSQC、HMBC； 附图说明 图1为本发明β-烟酰胺单核苷酸的合成工艺路线图。 图2为本发明β-烟酰胺单核苷酸的结构鉴定相关谱图，(a)1HNMR-NMN；(b)13CNMR- NMN；(c)DEPT135-NMN；(d)HCOSY-NMN；(e)HMBC-NMN；(f)HSQC-NMN；(g)NOESY-NMN。 图3为本发明β-烟酰胺单核苷酸的结构图。
技术实现要素：
下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整 的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本 发明中的实施例，本领域的技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施 例，都属于本发明的保护范围。 本发明