技术摘要：
本发明涉及宫颈癌干细胞特异性透膜肽和干扰RabJ基因的组合物的抑癌用途，该组合物可以有效地抑制内源性RabJ基因的表达，从而抑制肿瘤细胞生长。
背景技术：
人类免疫缺陷病毒(HIV-1)转录蛋白的反式激活因子是最早被发现能够穿过细胞 膜的因子，Derossi,D.等发现果蝇触角转录因子蛋白也能够穿过细胞膜进入细胞。随后人 们发现TAT蛋白中较短的一段碱性氨基酸区域，氨基酸残基在47-57的11个氨基酸短肽TAT (Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg)发挥透膜作用，而果蝇触角转录因子 蛋白中的第三螺旋同源区域的16个氨基酸区域发挥透膜活性，后来被命名为penetratin (Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys)。以TAT和 penetratin为基础，发展出了一类新型的能够递送各种分子的多肽载体:透膜肽。 近年来，各种跨学科研究报道了各类透膜肽作为递送工具递送核酸、蛋白、脂质体 和纳米颗粒等进入细胞。透膜肽的主要特点是低毒性，递送效率呈剂量依赖性，对要递送的 生物分子或纳米颗粒尺寸、类型没有限制。透膜肽的氨基酸数量通常在40个以下，通过各种 途径进入细胞(主要是内吞途径)，并且能够与核酸、蛋白和小分子等通过共价或非共价方 式结合，介导其进入细胞。透膜肽通常序列中含有大量阳离子赖氨酸和精氨酸(少数为不带 电荷或带负电)，在生理条件带有大量正电荷，可以和核酸通过静电相互作用结合形成多 肽/核酸纳米复合物，从而介导核酸进入细胞。科学家们已经利用TAT多肽递送反义核酸来 抑制肿瘤细胞P_糖蛋白的表达。 大部分细胞透膜肽自身的透膜机制多为非能量依赖的直接转导，而在转运分子量 较大的DNA等生物大分子时则大多采用内吞机制。例如，TAT是通过非能量依赖的方式直接 透膜，而TAT/DNA复合物转染HepG2和CHO1细胞系时是经过小窝蛋白介导的内吞途径进入细 胞。一般来说，阳离子透膜肽与细胞膜外带负电荷的糖胺聚糖基质如肝素等结合，小部分直 接转导进入细胞，绝大部分插入到细胞膜经各种蛋白(如小窝蛋白、网格蛋白)介导的内吞 或大包吞作用进入细胞。透膜肽/核酸复合物的尺寸对细胞透膜机制有较大影响，部分较小 尺寸的复合物可以直接转导进入细胞，而随着复合物尺寸的增大，小窝蛋白、网格蛋白介导 的内吞作用和大包吞作用呈逐渐增多趋势。 RNA干扰(RNAi)是一个过程，其中激活由21-23个核苷酸(nt)组成的小干扰RNA (siRNA)调节的细胞内途径会导致特定的靶向mRNA降解(在1、2中进行了综述)。为了在人细 胞中引起RNAi介导的基因沉默，将双链siRNA转染到细胞中。进入细胞后，siRNA双链体会经 历5'磷酸化，解链，并与RNA诱导的沉默复合物(RISC)结合。活化的RI SC(RISC*)和与目标 mRNA互补的解链反义链与mRNA靶标。然后发生mRNA靶标的单位点特异性切割，其位置参照 siRNA反义链的5'端确定。一旦发生切割，靶标mRNA降解，RISC循环用于另一种切割反应。由 于RNAi在沉默特定靶向基因方面的有效性，因此被广泛用于各种实验室应用和未来的临床 3 CN 111544445 A 说 明 书 2/7 页 治疗中。 由于RNAi在生物学和医学中的广泛潜在应用，因此重要的是了解RNAi的机制并开 发将siRNA成功递送至靶细胞的新方法。最近已经探索了许多递送siRNA的方法。一种方法 是将编码siRNA序列的DNA或RNA模板传递到可转录以表达siRNA的细胞中。这些基于DNA和 RNA的siRNA表达方法依赖于质粒或病毒载体进行递送，并且需要转染，稳定的载体整合以 及选择以维持第8、9、10、11、12、13、14、15代的表达，其他成功的方法都集中在直接将siRNA 传递到细胞中，而细胞摄取siRNA的保真度是使用这种方法导致RNAi的关键。目前，最常用 的siRNA递送方法是Lipofectamine转染。然而，这种方法的使用仅限于特定的细胞类型，并 且这种方法可能对细胞和动物有毒。 人RabJ是来源于健康成年人外周血单核细胞来源的树突状细胞一个新的小G蛋白 家族成员，其特征是在其蛋白质组成中包含三类功能域:N端(1-18氨基酸)和中间(210-216 氨基酸)的核定位信号(nuclear localization signal,NLS)、中间的Rab样功能域(19-209 氨基酸)和C端的J功能域(217-273氨基酸)，并与Ras家族分子有较高同源性。三类功能域分 别介导RabJ的核定位；与细胞外信号调控激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERKl/2)激酶(ERK kinase}MEK1/2)、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC) ,磷脂酞 肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase ,PI3K)的P85亚基、P53亚基相互作用；与 HSC70和Raf(Ras相关因子，Ras-associated factor)相互作用等功能。RabJ的核着酸序列 和氨基酸序列以及制法公开于中国专利申请CN01126826.3中。 此前已有针对RabJ的siRNA，但是设计的siRNA在抑制效率以及转染效率上都有改 进的空间。
技术实现要素：
本发明提供了特异性针对RabJ基因的siRNA。 针对RabJ基因的siRNA，其正义链分别如下所示： SiRabJ1:5’-gcagatgccattcgcagaat-3’(SEQ ID N0:1) SiRabJ2:5’-tagcagtgctagtttcacc-3’(SEQ ID N0:2) 根据本发明的另一种实施方式，所述正义链的3′末端可以连接1至3个核苷酸，从 而在所述正义链和所述反义链互补形成所述双链结构后，在所述双链结构的至少一个末端 形成由所述1至3个核苷酸构成的3′突出端。其中，优选所述3′突出端为由连续的两个脱氧 胸腺嘧啶核苷酸dTdT或连续的两个尿嘧啶核苷酸UU构成。 根据本发明的另一种实施方式，所述正义链和所述反义链链中分别包含至少一个 被修饰的核苷酸基团。其中，所述被修饰的核苷酸基团为磷酸基团、核糖基团或碱基中的至 少一种被修饰的核苷酸基团。优选所述被修饰的核苷酸基团为核糖基团的2′-羟基被甲氧 基或氟取代的核苷酸基团。 更重要的，本发明涉及一种特异性针对宫颈癌干细胞的透膜肽。 更具体的，本发明提供一种筛选透膜肽的方法，将宫颈癌干细胞加入含0.1％BSA 的DMEM培养基孵育，加入随机十二肽噬菌体展示文库的原液，放入37℃摇床，，温和振摇孵 育，继续在细胞培养箱中孵育。37℃孵育1h后终止噬菌体的内化。弃去未结合的噬菌体上 清，洗涤细胞。用胰酶混合液消化干细胞，置于培养箱中保温至镜下观察细胞圆缩脱离皿 4 CN 111544445 A 说 明 书 3/7 页 壁。离心，去上清，再加入轻柔重悬细胞，离心，反复洗涤细胞3次。将沉淀的细胞置于液氮和 37℃恒温水浴中反复冻融5次，并充分震荡。冻融物中加入2ml含1％TritonX-100的PBS(含 有PMSF和Cocktail)，室温下作用2h以裂解细胞。4℃下5000r/min离心10min。离心后的上清 即为筛选的分离液。取重复上述筛选方法5次，筛选得到的噬菌体回收率逐步提高，内化进 入干细胞的噬菌体数目得到提高，目标噬菌体得到明显的富集。将筛选得到的噬菌体克隆 扩增液20μl，96℃金属浴加热10min，取上清1μl作为DNA模板。根据十二肽插入序列的上下 游共有序列设计引物，进行PCR反应。对经电泳鉴定为有插入片段的噬菌体克隆，取其PCR产 物进行测序。根据编码链中噬菌体pⅢ基因的阅读框架推导出与pⅢ蛋白融合的外源十二肽 的氨基酸序列。根据测序结果，有1条序列出现了4重复，该高峰度出现的十二肽序列即为具 有干细胞透性特性的TM-2多肽，其序列为SEQ ID NO：3所示。 此外，本发明还提供一种取透膜肽与siRNA偶联的方法，具体的为siRNA用PBS稀 释；将多肽样品配成溶液，按照多肽/siRNA电荷比N/P为10的量取多肽溶液，用PBS稀释；然 后将多肽溶液逐滴加如到siRNA溶液中，用移液器吹打均匀，涡旋10s，放置在室温孵育 3Omin让阳离子多肽与DNA充分结合形成纳米复合物；最后用无血清的DMEM培养液稀释到 500ul用于细胞转染。 另一方面，本发明提供一种抑制乳腺癌干细胞内RabJ基因表达的方法，该方法包 括向乳腺癌干细胞内导入如上所述的siRNA偶联物，从而使所述siRNA能够序列特异性地诱 导所述RabJ基因表达的抑制。 另一方面，本发明提供如上所述的siRNA偶联物在制备治疗和/或预防乳腺癌的药 物中的用途。 有益效果 本发明筛选得到了特异性的乳腺癌干细胞的透膜肽，能够特异性的针对乳腺癌干 细胞来提供相应的基因递送能力，同时本发明还设计了特异性的siRNA能够序列特异性地 介导RabJ基因表达的抑制，可以有效地抑制内源性RabJ基因的表达，从而抑制肿瘤细胞生 长。 附图说明 图1示出TM-2多肽对细胞活力的影响，黑色代表TM-2多肽，灰色代表TAT多肽。 图2示出siRNA对基因表达量影响的检测结果。 图3示出蛋白表达水平的检测结果，从左至右依次代表TM-2多肽 SEQ ID NO： 1siRNA，TAT多肽 SEQ ID NO：1siRNA，TM-2多肽 SEQ ID NO：2siRNA，TAT多肽 SEQ ID NO： 2siRNA，阴性对照。
本发明涉及宫颈癌干细胞特异性透膜肽和干扰RabJ基因的组合物的抑癌用途，该组合物可以有效地抑制内源性RabJ基因的表达，从而抑制肿瘤细胞生长。
背景技术：
人类免疫缺陷病毒(HIV-1)转录蛋白的反式激活因子是最早被发现能够穿过细胞 膜的因子，Derossi,D.等发现果蝇触角转录因子蛋白也能够穿过细胞膜进入细胞。随后人 们发现TAT蛋白中较短的一段碱性氨基酸区域，氨基酸残基在47-57的11个氨基酸短肽TAT (Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg)发挥透膜作用，而果蝇触角转录因子 蛋白中的第三螺旋同源区域的16个氨基酸区域发挥透膜活性，后来被命名为penetratin (Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys)。以TAT和 penetratin为基础，发展出了一类新型的能够递送各种分子的多肽载体:透膜肽。 近年来，各种跨学科研究报道了各类透膜肽作为递送工具递送核酸、蛋白、脂质体 和纳米颗粒等进入细胞。透膜肽的主要特点是低毒性，递送效率呈剂量依赖性，对要递送的 生物分子或纳米颗粒尺寸、类型没有限制。透膜肽的氨基酸数量通常在40个以下，通过各种 途径进入细胞(主要是内吞途径)，并且能够与核酸、蛋白和小分子等通过共价或非共价方 式结合，介导其进入细胞。透膜肽通常序列中含有大量阳离子赖氨酸和精氨酸(少数为不带 电荷或带负电)，在生理条件带有大量正电荷，可以和核酸通过静电相互作用结合形成多 肽/核酸纳米复合物，从而介导核酸进入细胞。科学家们已经利用TAT多肽递送反义核酸来 抑制肿瘤细胞P_糖蛋白的表达。 大部分细胞透膜肽自身的透膜机制多为非能量依赖的直接转导，而在转运分子量 较大的DNA等生物大分子时则大多采用内吞机制。例如，TAT是通过非能量依赖的方式直接 透膜，而TAT/DNA复合物转染HepG2和CHO1细胞系时是经过小窝蛋白介导的内吞途径进入细 胞。一般来说，阳离子透膜肽与细胞膜外带负电荷的糖胺聚糖基质如肝素等结合，小部分直 接转导进入细胞，绝大部分插入到细胞膜经各种蛋白(如小窝蛋白、网格蛋白)介导的内吞 或大包吞作用进入细胞。透膜肽/核酸复合物的尺寸对细胞透膜机制有较大影响，部分较小 尺寸的复合物可以直接转导进入细胞，而随着复合物尺寸的增大，小窝蛋白、网格蛋白介导 的内吞作用和大包吞作用呈逐渐增多趋势。 RNA干扰(RNAi)是一个过程，其中激活由21-23个核苷酸(nt)组成的小干扰RNA (siRNA)调节的细胞内途径会导致特定的靶向mRNA降解(在1、2中进行了综述)。为了在人细 胞中引起RNAi介导的基因沉默，将双链siRNA转染到细胞中。进入细胞后，siRNA双链体会经 历5'磷酸化，解链，并与RNA诱导的沉默复合物(RISC)结合。活化的RI SC(RISC*)和与目标 mRNA互补的解链反义链与mRNA靶标。然后发生mRNA靶标的单位点特异性切割，其位置参照 siRNA反义链的5'端确定。一旦发生切割，靶标mRNA降解，RISC循环用于另一种切割反应。由 于RNAi在沉默特定靶向基因方面的有效性，因此被广泛用于各种实验室应用和未来的临床 3 CN 111544445 A 说 明 书 2/7 页 治疗中。 由于RNAi在生物学和医学中的广泛潜在应用，因此重要的是了解RNAi的机制并开 发将siRNA成功递送至靶细胞的新方法。最近已经探索了许多递送siRNA的方法。一种方法 是将编码siRNA序列的DNA或RNA模板传递到可转录以表达siRNA的细胞中。这些基于DNA和 RNA的siRNA表达方法依赖于质粒或病毒载体进行递送，并且需要转染，稳定的载体整合以 及选择以维持第8、9、10、11、12、13、14、15代的表达，其他成功的方法都集中在直接将siRNA 传递到细胞中，而细胞摄取siRNA的保真度是使用这种方法导致RNAi的关键。目前，最常用 的siRNA递送方法是Lipofectamine转染。然而，这种方法的使用仅限于特定的细胞类型，并 且这种方法可能对细胞和动物有毒。 人RabJ是来源于健康成年人外周血单核细胞来源的树突状细胞一个新的小G蛋白 家族成员，其特征是在其蛋白质组成中包含三类功能域:N端(1-18氨基酸)和中间(210-216 氨基酸)的核定位信号(nuclear localization signal,NLS)、中间的Rab样功能域(19-209 氨基酸)和C端的J功能域(217-273氨基酸)，并与Ras家族分子有较高同源性。三类功能域分 别介导RabJ的核定位；与细胞外信号调控激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERKl/2)激酶(ERK kinase}MEK1/2)、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC) ,磷脂酞 肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase ,PI3K)的P85亚基、P53亚基相互作用；与 HSC70和Raf(Ras相关因子，Ras-associated factor)相互作用等功能。RabJ的核着酸序列 和氨基酸序列以及制法公开于中国专利申请CN01126826.3中。 此前已有针对RabJ的siRNA，但是设计的siRNA在抑制效率以及转染效率上都有改 进的空间。
技术实现要素：
本发明提供了特异性针对RabJ基因的siRNA。 针对RabJ基因的siRNA，其正义链分别如下所示： SiRabJ1:5’-gcagatgccattcgcagaat-3’(SEQ ID N0:1) SiRabJ2:5’-tagcagtgctagtttcacc-3’(SEQ ID N0:2) 根据本发明的另一种实施方式，所述正义链的3′末端可以连接1至3个核苷酸，从 而在所述正义链和所述反义链互补形成所述双链结构后，在所述双链结构的至少一个末端 形成由所述1至3个核苷酸构成的3′突出端。其中，优选所述3′突出端为由连续的两个脱氧 胸腺嘧啶核苷酸dTdT或连续的两个尿嘧啶核苷酸UU构成。 根据本发明的另一种实施方式，所述正义链和所述反义链链中分别包含至少一个 被修饰的核苷酸基团。其中，所述被修饰的核苷酸基团为磷酸基团、核糖基团或碱基中的至 少一种被修饰的核苷酸基团。优选所述被修饰的核苷酸基团为核糖基团的2′-羟基被甲氧 基或氟取代的核苷酸基团。 更重要的，本发明涉及一种特异性针对宫颈癌干细胞的透膜肽。 更具体的，本发明提供一种筛选透膜肽的方法，将宫颈癌干细胞加入含0.1％BSA 的DMEM培养基孵育，加入随机十二肽噬菌体展示文库的原液，放入37℃摇床，，温和振摇孵 育，继续在细胞培养箱中孵育。37℃孵育1h后终止噬菌体的内化。弃去未结合的噬菌体上 清，洗涤细胞。用胰酶混合液消化干细胞，置于培养箱中保温至镜下观察细胞圆缩脱离皿 4 CN 111544445 A 说 明 书 3/7 页 壁。离心，去上清，再加入轻柔重悬细胞，离心，反复洗涤细胞3次。将沉淀的细胞置于液氮和 37℃恒温水浴中反复冻融5次，并充分震荡。冻融物中加入2ml含1％TritonX-100的PBS(含 有PMSF和Cocktail)，室温下作用2h以裂解细胞。4℃下5000r/min离心10min。离心后的上清 即为筛选的分离液。取重复上述筛选方法5次，筛选得到的噬菌体回收率逐步提高，内化进 入干细胞的噬菌体数目得到提高，目标噬菌体得到明显的富集。将筛选得到的噬菌体克隆 扩增液20μl，96℃金属浴加热10min，取上清1μl作为DNA模板。根据十二肽插入序列的上下 游共有序列设计引物，进行PCR反应。对经电泳鉴定为有插入片段的噬菌体克隆，取其PCR产 物进行测序。根据编码链中噬菌体pⅢ基因的阅读框架推导出与pⅢ蛋白融合的外源十二肽 的氨基酸序列。根据测序结果，有1条序列出现了4重复，该高峰度出现的十二肽序列即为具 有干细胞透性特性的TM-2多肽，其序列为SEQ ID NO：3所示。 此外，本发明还提供一种取透膜肽与siRNA偶联的方法，具体的为siRNA用PBS稀 释；将多肽样品配成溶液，按照多肽/siRNA电荷比N/P为10的量取多肽溶液，用PBS稀释；然 后将多肽溶液逐滴加如到siRNA溶液中，用移液器吹打均匀，涡旋10s，放置在室温孵育 3Omin让阳离子多肽与DNA充分结合形成纳米复合物；最后用无血清的DMEM培养液稀释到 500ul用于细胞转染。 另一方面，本发明提供一种抑制乳腺癌干细胞内RabJ基因表达的方法，该方法包 括向乳腺癌干细胞内导入如上所述的siRNA偶联物，从而使所述siRNA能够序列特异性地诱 导所述RabJ基因表达的抑制。 另一方面，本发明提供如上所述的siRNA偶联物在制备治疗和/或预防乳腺癌的药 物中的用途。 有益效果 本发明筛选得到了特异性的乳腺癌干细胞的透膜肽，能够特异性的针对乳腺癌干 细胞来提供相应的基因递送能力，同时本发明还设计了特异性的siRNA能够序列特异性地 介导RabJ基因表达的抑制，可以有效地抑制内源性RabJ基因的表达，从而抑制肿瘤细胞生 长。 附图说明 图1示出TM-2多肽对细胞活力的影响，黑色代表TM-2多肽，灰色代表TAT多肽。 图2示出siRNA对基因表达量影响的检测结果。 图3示出蛋白表达水平的检测结果，从左至右依次代表TM-2多肽 SEQ ID NO： 1siRNA，TAT多肽 SEQ ID NO：1siRNA，TM-2多肽 SEQ ID NO：2siRNA，TAT多肽 SEQ ID NO： 2siRNA，阴性对照。
