技术摘要：
本发明属于分析化学中的光电化学传感技术领域，特别涉及一种基于脂质体信号放大策略的新型光电化学生物传感器的设计及在检测脂肪酸结合蛋白FABP中的应用技术。所述光电化学传感器由多孔二氧化钛纳米管TiO2 NTs与金纳米簇Au NCs组合而成。其制备方法简便易行、快速、成 全部
背景技术：
脂肪酸结合蛋白FABP是一种小分子量的细胞溶质蛋白，广泛分布于人体内的各个 组织中并发挥重要的作用如：作为脂肪酸的运载体参与调节细胞脂肪酸隔室化分布和代 谢；作为协同因子增强以脂肪酸代谢为基础的细胞合成或氧化；参与调节细胞的增殖与生 长、胰岛素信息传递及胆红素、甾醇、前列腺素等的代谢活动。研究表明，在发生心肌梗死或 急性心梗病后30分钟到3小时内，血浆中的FABP将开始升高并与12-24小时内恢复正常，其 灵敏度可达78％，明显高于其他常规指标如肌酸激酶、肌酸激酶同工酶等，因此FABP可作为 急性心梗疾病早期诊断的一种重要指标。常见的检测FABP的方法主要有放射免疫法、ELISA 酶联免疫法、荧光分析法等。虽然这些方法取得一定的成功，但仍存在不足如灵敏度低、硬 件设备要求高、成本高等问题。因此，开发一种新型的简便的高灵敏度检测FABP的传感器具 有重要的实用价值和应用前景。 随着材料化学和生物技术的快速发展，在光电化学过程和电化学生物传感技术的 基础上已开发出新一代光电化学(Photoelectrochemical，PEC)生物传感器技术，为生物分 析提供了一种新的检测手段。光电化学过程指具有光电活性的材料在合适的光照作用下所 发生的经由电子激发和电荷转移形成的光电转换过程。光电活性物质在受光激发后产生电 子空穴对，随后发生复合或电荷转移，一定条件下，导带上的电子可以向电极或电解池溶液 中电子受体转移而产生相应的阳极或阴极光电流响应。光电化学生物传感技术的定量分析 基础是基于光照作用下，目标物与光电活性材料之间直接或间接的相互作用或在目标物进 行高特异性识别反应后(改变电极表面或周围状态，如产生位阻效应等)工作站所监测到的 电信号变化与目标物浓度之间的关系。检测过程中，光被用作激发信号来激发光电活性材 料而电信号则作为检测信号，二者分属于不同形式的能量，因此该技术可进一步降低背景 信号，实现更高灵敏的检测。
技术实现要素：
本发明的目的在于解决现有技术问题的不足，提供一种基于脂质体信号放大策略 的新型光电化学生物传感器的设计及在检测脂肪酸结合蛋白FABP中的应用技术。所述技术 通过改变电极表面Au NCs对TiO2NTs敏化作用来实现对FABP的灵敏检测。 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案： 一种基于光电化学传感的脂肪酸结合蛋白检测方法，包括以下步骤： (1)光电化学传感器的制备 a.金纳米簇Au NCs的制备： 将23mg谷胱甘肽溶于23mL水中，滴加2mL质量分数1％的HAuCl4溶液，然后加热至 4 CN 111579613 A 说 明 书 2/5 页 70℃并搅拌一定时间，待反应结束，冷却至室温得到金纳米簇Au NCs溶液； b.多孔二氧化钛纳米管TiO2NTs电极的制备： 将金属钛片连接于电源正极，石墨棒做负极，以质量分数0.3％的NH4F乙二醇溶液 为电解液，设定直流电压为50V通电2h进行电氧化，用超声仪清洗钛片并吹干，设定直流电 压为50V通电30min，水洗并吹干得到TiO2NTs，将得到的TiO2NTs置于450℃的马弗炉中煅烧 60min，得到多孔二氧化钛纳米管TiO2NTs电极； c.Au NCs@TiO2NTs电极的制备： 将步骤b中得到的TiO2NTs电极置于步骤a中得到的Au NCs溶液中浸泡一段时间， 使得Au NCs吸附在TiO2NTs表面并对TiO2NTs进行敏化，得到Au NCs@TiO2NTs电极； (2)脂肪酸结合蛋白的检测方法 d.脂质体Ab2-ALPL的制备： 将二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺DPPE、1,2-棕榈酰磷脂酰甘油DPPG、二棕榈酰磷脂酰 胆碱DPPC和胆固醇CHOL溶于二氯甲烷/甲醇混合溶液中，减压脱溶得到脂质体膜后加入碱 性磷酸酶ALP溶液水化过夜，超声并过滤得到装载有ALP的脂质体ALPL，将鼠抗人脂肪酸结 合蛋白单克隆抗体2(Ab2)通过戊二醛修饰到ALPL表面得到Ab2-ALPL； e.光电化学脂肪酸结合蛋白检测体系的构建： 1)取60uL 0.2mg/mL的鼠抗人脂肪酸结合蛋白单克隆抗体1(Ab1)加入96孔板中4 ℃下孵育12h，将Ab1修饰在96孔板中，然后用PBS缓冲液小心地洗去未结合在96孔板上的 Ab1，然后加入牛血清蛋白BSA 4℃下孵育2h对多余位点进行封闭； 2)加入待检测的目标抗原Ag(FABP)在4℃下孵育1h，Ag通过免疫反应结合到Ab1上 形成Ab1-Ag复合物，PBS缓冲液洗去未结合的Ag； 3)加入40uL步骤d得到的Ab2-ALPL在37℃下孵育1h，通过三明治免疫反应结合到 Ab1-Ag复合物形成Ab1-Ag-Ab2-ALPL免疫复合物，PBS缓冲液洗去未结合的Ab2-ALPL，然后加 入曲拉通Triton X-100进行脂质体裂解，得到含有ALP的脂质体裂解液； 4)将3)得到的脂质体裂解液滴加到步骤c得到的Au NCs@TiO2NTs电极上，然后再 加入磷酸抗坏血酸酯AAP和HAuCl4溶液37℃孵育1h，使得ALP可以水解AAP产生具有还原性 的抗坏血酸AA，以Au NCs作为晶种，AA将还原HAuCl4溶液中的Au3 在Au NCs上原位生长，使 得Au NCs原位长大成金纳米颗粒Au NPs，改变了原先Au NCs的敏化效果，抑制电极的光电 流信号； 5)孵育后的Au NCs@TiO2NTs电极用PBS缓冲液冲洗，然后在实验室自行搭建的光 电化学测试系统上测量该电极的光电流强度，测试条件为：5W的LED灯作为激发光源；光电 测试采用三电极体系：Au NCs@TiO2NTs电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，Pt丝为对电 极；光电流由上海辰华仪器公司的CHI660C工作站测定，设置偏压为0V；电解液为pH值7.4的 含20mM三乙醇胺的10mM的PBS缓冲液。 优选的，所述步骤a中搅拌时间为10-48h，更优选的搅拌时间为24h。 优选的，所述步骤c中浸泡时间为1-48h，更优选的浸泡时间为8h。 优选的，所述步骤d中二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺DPPE、二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC、 1,2-棕榈酰磷脂酰甘油DPPG、胆固醇CHOL的质量比为5:15:15:7。 优选的，所述步骤d中二氯甲烷/甲醇混合溶液的体积比为4:1。 5 CN 111579613 A 说 明 书 3/5 页 优选的，所述步骤e 3)中使用40uL 0.05％的曲拉通Triton X-100进行脂质体裂 解。 优选的，所述步骤e中PBS缓冲液为10mM pH 7.4的磷酸盐缓冲液。 优选的，Au NCs@TiO2NTs电极实现对脂肪酸结合蛋白的检测在于其光电流的变化 程度与脂肪酸结合蛋白浓度有关。 本发明与现有技术相比，其有益效果主要体现在： 本发明所述的基于脂质体信号放大策略的新型光电化学生物传感器在检测脂肪 酸结合蛋白FABP中的应用技术，具有制备方法简单易行、成本低、无污染的优点，并且所制 备的光电化学生物传感器稳定性好、输出信号稳定；同时，在温和条件下，该传感器的灵敏 度高，可实现对低浓度FABP的灵敏检测，并且选择性好，对FABP具有非常好的专一性。因此， 该光电化学生物传感器具有重要的意义和很好的应用前景。 附图说明 图1为所述的光电化学生物传感器稳定性测试的光电流图； 图2为所述的光电化学生物传感器检测FABP的光电流图； 图3为所述的光电化学生物传感器的选择性实验光电流图。
本发明属于分析化学中的光电化学传感技术领域，特别涉及一种基于脂质体信号放大策略的新型光电化学生物传感器的设计及在检测脂肪酸结合蛋白FABP中的应用技术。所述光电化学传感器由多孔二氧化钛纳米管TiO2 NTs与金纳米簇Au NCs组合而成。其制备方法简便易行、快速、成 全部
背景技术：
脂肪酸结合蛋白FABP是一种小分子量的细胞溶质蛋白，广泛分布于人体内的各个 组织中并发挥重要的作用如：作为脂肪酸的运载体参与调节细胞脂肪酸隔室化分布和代 谢；作为协同因子增强以脂肪酸代谢为基础的细胞合成或氧化；参与调节细胞的增殖与生 长、胰岛素信息传递及胆红素、甾醇、前列腺素等的代谢活动。研究表明，在发生心肌梗死或 急性心梗病后30分钟到3小时内，血浆中的FABP将开始升高并与12-24小时内恢复正常，其 灵敏度可达78％，明显高于其他常规指标如肌酸激酶、肌酸激酶同工酶等，因此FABP可作为 急性心梗疾病早期诊断的一种重要指标。常见的检测FABP的方法主要有放射免疫法、ELISA 酶联免疫法、荧光分析法等。虽然这些方法取得一定的成功，但仍存在不足如灵敏度低、硬 件设备要求高、成本高等问题。因此，开发一种新型的简便的高灵敏度检测FABP的传感器具 有重要的实用价值和应用前景。 随着材料化学和生物技术的快速发展，在光电化学过程和电化学生物传感技术的 基础上已开发出新一代光电化学(Photoelectrochemical，PEC)生物传感器技术，为生物分 析提供了一种新的检测手段。光电化学过程指具有光电活性的材料在合适的光照作用下所 发生的经由电子激发和电荷转移形成的光电转换过程。光电活性物质在受光激发后产生电 子空穴对，随后发生复合或电荷转移，一定条件下，导带上的电子可以向电极或电解池溶液 中电子受体转移而产生相应的阳极或阴极光电流响应。光电化学生物传感技术的定量分析 基础是基于光照作用下，目标物与光电活性材料之间直接或间接的相互作用或在目标物进 行高特异性识别反应后(改变电极表面或周围状态，如产生位阻效应等)工作站所监测到的 电信号变化与目标物浓度之间的关系。检测过程中，光被用作激发信号来激发光电活性材 料而电信号则作为检测信号，二者分属于不同形式的能量，因此该技术可进一步降低背景 信号，实现更高灵敏的检测。
技术实现要素：
本发明的目的在于解决现有技术问题的不足，提供一种基于脂质体信号放大策略 的新型光电化学生物传感器的设计及在检测脂肪酸结合蛋白FABP中的应用技术。所述技术 通过改变电极表面Au NCs对TiO2NTs敏化作用来实现对FABP的灵敏检测。 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案： 一种基于光电化学传感的脂肪酸结合蛋白检测方法，包括以下步骤： (1)光电化学传感器的制备 a.金纳米簇Au NCs的制备： 将23mg谷胱甘肽溶于23mL水中，滴加2mL质量分数1％的HAuCl4溶液，然后加热至 4 CN 111579613 A 说 明 书 2/5 页 70℃并搅拌一定时间，待反应结束，冷却至室温得到金纳米簇Au NCs溶液； b.多孔二氧化钛纳米管TiO2NTs电极的制备： 将金属钛片连接于电源正极，石墨棒做负极，以质量分数0.3％的NH4F乙二醇溶液 为电解液，设定直流电压为50V通电2h进行电氧化，用超声仪清洗钛片并吹干，设定直流电 压为50V通电30min，水洗并吹干得到TiO2NTs，将得到的TiO2NTs置于450℃的马弗炉中煅烧 60min，得到多孔二氧化钛纳米管TiO2NTs电极； c.Au NCs@TiO2NTs电极的制备： 将步骤b中得到的TiO2NTs电极置于步骤a中得到的Au NCs溶液中浸泡一段时间， 使得Au NCs吸附在TiO2NTs表面并对TiO2NTs进行敏化，得到Au NCs@TiO2NTs电极； (2)脂肪酸结合蛋白的检测方法 d.脂质体Ab2-ALPL的制备： 将二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺DPPE、1,2-棕榈酰磷脂酰甘油DPPG、二棕榈酰磷脂酰 胆碱DPPC和胆固醇CHOL溶于二氯甲烷/甲醇混合溶液中，减压脱溶得到脂质体膜后加入碱 性磷酸酶ALP溶液水化过夜，超声并过滤得到装载有ALP的脂质体ALPL，将鼠抗人脂肪酸结 合蛋白单克隆抗体2(Ab2)通过戊二醛修饰到ALPL表面得到Ab2-ALPL； e.光电化学脂肪酸结合蛋白检测体系的构建： 1)取60uL 0.2mg/mL的鼠抗人脂肪酸结合蛋白单克隆抗体1(Ab1)加入96孔板中4 ℃下孵育12h，将Ab1修饰在96孔板中，然后用PBS缓冲液小心地洗去未结合在96孔板上的 Ab1，然后加入牛血清蛋白BSA 4℃下孵育2h对多余位点进行封闭； 2)加入待检测的目标抗原Ag(FABP)在4℃下孵育1h，Ag通过免疫反应结合到Ab1上 形成Ab1-Ag复合物，PBS缓冲液洗去未结合的Ag； 3)加入40uL步骤d得到的Ab2-ALPL在37℃下孵育1h，通过三明治免疫反应结合到 Ab1-Ag复合物形成Ab1-Ag-Ab2-ALPL免疫复合物，PBS缓冲液洗去未结合的Ab2-ALPL，然后加 入曲拉通Triton X-100进行脂质体裂解，得到含有ALP的脂质体裂解液； 4)将3)得到的脂质体裂解液滴加到步骤c得到的Au NCs@TiO2NTs电极上，然后再 加入磷酸抗坏血酸酯AAP和HAuCl4溶液37℃孵育1h，使得ALP可以水解AAP产生具有还原性 的抗坏血酸AA，以Au NCs作为晶种，AA将还原HAuCl4溶液中的Au3 在Au NCs上原位生长，使 得Au NCs原位长大成金纳米颗粒Au NPs，改变了原先Au NCs的敏化效果，抑制电极的光电 流信号； 5)孵育后的Au NCs@TiO2NTs电极用PBS缓冲液冲洗，然后在实验室自行搭建的光 电化学测试系统上测量该电极的光电流强度，测试条件为：5W的LED灯作为激发光源；光电 测试采用三电极体系：Au NCs@TiO2NTs电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，Pt丝为对电 极；光电流由上海辰华仪器公司的CHI660C工作站测定，设置偏压为0V；电解液为pH值7.4的 含20mM三乙醇胺的10mM的PBS缓冲液。 优选的，所述步骤a中搅拌时间为10-48h，更优选的搅拌时间为24h。 优选的，所述步骤c中浸泡时间为1-48h，更优选的浸泡时间为8h。 优选的，所述步骤d中二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺DPPE、二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC、 1,2-棕榈酰磷脂酰甘油DPPG、胆固醇CHOL的质量比为5:15:15:7。 优选的，所述步骤d中二氯甲烷/甲醇混合溶液的体积比为4:1。 5 CN 111579613 A 说 明 书 3/5 页 优选的，所述步骤e 3)中使用40uL 0.05％的曲拉通Triton X-100进行脂质体裂 解。 优选的，所述步骤e中PBS缓冲液为10mM pH 7.4的磷酸盐缓冲液。 优选的，Au NCs@TiO2NTs电极实现对脂肪酸结合蛋白的检测在于其光电流的变化 程度与脂肪酸结合蛋白浓度有关。 本发明与现有技术相比，其有益效果主要体现在： 本发明所述的基于脂质体信号放大策略的新型光电化学生物传感器在检测脂肪 酸结合蛋白FABP中的应用技术，具有制备方法简单易行、成本低、无污染的优点，并且所制 备的光电化学生物传感器稳定性好、输出信号稳定；同时，在温和条件下，该传感器的灵敏 度高，可实现对低浓度FABP的灵敏检测，并且选择性好，对FABP具有非常好的专一性。因此， 该光电化学生物传感器具有重要的意义和很好的应用前景。 附图说明 图1为所述的光电化学生物传感器稳定性测试的光电流图； 图2为所述的光电化学生物传感器检测FABP的光电流图； 图3为所述的光电化学生物传感器的选择性实验光电流图。
