技术摘要：
本发明属基因工程生物技术领域，具体公开了一种肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的设计、制备方法及其药学应用。该肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体是由带有环状结构并含有NGR序列的短肽、连接肽、肿瘤坏死因子相关凋亡配体组成融合蛋白质，通过基因工程  全部
背景技术：
肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)是肿瘤坏死因子超家族中的一个成员。与肿 瘤坏死因子超家族其它成员类似，可溶性形式的肿瘤坏死因子相关配体以三聚体形式与靶 细胞表面三聚体化的受体分子结合而发挥生物学功能。肿瘤坏死因子相关凋亡配体诱导凋 亡的作用是通过与肿瘤细胞上的死亡受体4(DR4)和死亡受体5(DR5)的相互作用传递死亡 信号而实现的。虽然肿瘤坏死因子超家族的其它成员由于具有全身性的毒副作用而使应用 受到限制，但是肿瘤坏死因子相关凋亡配体是一个相对安全、具有肿瘤选择性的抗肿瘤物 质。肿瘤坏死因子相关凋亡配体在体外能诱导多种肿瘤细胞和癌化细胞的凋亡，并且在小 鼠的移植异种肿瘤，包括结肠癌、乳腺癌、多重性骨髓瘤、神经胶质瘤、前列腺癌等多种模型 中具有较好的抗肿瘤活性。尤其重要的是，在小鼠和非人类灵长类动物中全身给药时， TRAIL表现出较小或没有毒性。基于以上原因，重组肿瘤坏死因子相关凋亡配体已经在进行 肿瘤治疗的临床研究。 但是近来一些报道显示：除了诱导肿瘤细胞的凋亡外，肿瘤坏死因子相关凋亡配 体还涉及到天然免疫和获得性免疫，和自身免疫性疾病相关。例如，近来的研究报道表明它 在胸腺的发育过程中调节负向选择或凋亡胸腺细胞，并且在诱发自体免疫性疾病如I型糖 尿病中起重要作用。此外，肿瘤坏死因子相关凋亡配体的受体在整个身体广泛性表达，肿瘤 坏死因子相关凋亡配体还参与肝细胞死亡和肝炎。因此在临床上重复、全身性使用大剂量 外源性肿瘤坏死因子相关凋亡配体蛋白可能会导致不可预料的免疫结果。这些报道使科学 家非常担心肿瘤坏死因子相关凋亡配体在临床中重复和持久使用时产生潜在的副作用。如 何在肿瘤治疗时，避免肿瘤坏死因子相关凋亡配体对其它组织的毒副作用，这是肿瘤坏死 因子相关凋亡配体(TRAIL)在潜在的临床应用中面临的难题。
技术实现要素：
为克服野生型肿瘤坏死因子相关凋亡配体在肿瘤治疗方面所面临的缺陷，本发明 目的在于：发明一种具有肿瘤组织靶向性的肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体，将其靶向输 送到肿瘤组织中，以此提高肿瘤坏死因子相关凋亡配体的疗效，降低其毒副作用，从而能在 治疗肿瘤疾病中得到应用。 氨基酞酶N(Aminopeptidase  N，APN)/CD13蛋白是一种经研究证明只表达在肿瘤 新生血管内皮细胞上的蛋白质(Pasqualini  R，Koivunen  E，Kain  R等，Cancer  Res.2000， 3 CN 111548425 A 说　明　书 2/13 页 60：722-727)，处于静止状态的正常血管内皮细胞很少表达CD13，近年来发现氨基酞酶N/ CD13也与肿瘤的转移和预后相关联(Haraguchi  N，Ishii  H，Mimori  K等，J  Clin  Invest .2010，120：3326-3339；Fontijn  D，DuyndamMC，van  Berkel  MP等，Br  J  Ca ncer .2006，94：1627-1636；Fujii  H，Naka jima M，Saiki  I等，Clin  Exp  Metastasis.1995，13：337-344)。 为达到实现肿瘤坏死因子相关凋亡配体肿瘤组织靶向输送，提高其抗肿瘤疗效、 降低其毒副作用的目的，本发明是通过以下技术方案来实现的： 一种具有肿瘤组织靶向性的肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体，是具有序列表中序列1 氨基酸残基序列的蛋白质，它是通过基因工程方法构建由CD13的配体、连接肽、肿瘤坏死因 子相关凋亡配体组成的肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体融合蛋白质，即利用常规基因工程 方法通过人工合成或者克隆构建肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的编码基因、可溶性地重 组表达和简便地分离纯化。所述CD13的配体可以是一种含有NGR序列的多肽，优选为一种带 有环状结构的、含有NGR序列的多肽，例如短肽CNGRC。 上述的CD13的配体和肿瘤坏死因子相关凋亡配体所构成的肿瘤靶向性肿瘤坏死 因子相关凋亡配体变体之间可以添加一段具有柔性结构的、不含支链氨基酸的短肽，其中， 短肽为1-25个氨基酸残基，主要由甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸等不含支链的氨基酸组成。 上述的CD13的配体放置于肿瘤坏死因子相关凋亡配体N端时，在CD13的配体之前 增加一个不含支链的氨基酸，主要是丙氨酸或甘氨酸，以防表达时出现的N端氨基酸降解， 影响CD13配体的功能。 所述合成的CD13的配体和肿瘤坏死因子相关凋亡配体所组成肿瘤靶向性肿瘤坏 死因子相关凋亡配体变体在制备肿瘤治疗药物中具有良好的应用。以上述肿瘤靶向性肿瘤 坏死因子相关凋亡配体制备的肿瘤治疗药物与现有化疗、放疗、中药治疗、生物治疗等方法 在肿瘤治疗中能够得到联合运用。 进一步地，一种在大肠杆菌中可溶性表达和简便分离纯化大量的、高纯度肿瘤靶 向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的聚体的方法。尽管目前肿瘤坏死因子相关凋亡配体 在大肠杆菌中表达多为无生物活性的包涵体产物，而本发明中的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子 相关凋亡配体变体的分子结构和分子量比野生型肿瘤坏死因子相关凋亡配体更为复杂，因 此在大肠杆菌中表达时，其包涵体形成将更为严重、纯化将更为复杂。本发明采用了低温下 培养和诱导表达肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的表达方法，使得表达产物有 效避免了包涵体的形成；本发明同时利用了肿瘤坏死因子相关凋亡配体具有鏊合金属离子 的生物功能，利用离子交换层析和金属亲和层析相结合使得肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关 凋亡配体变体得到了有效的纯化、获得了高纯度的蛋白质产物，而且纯化产物具有高比例 的聚体形式，因此具有非常好的生物活性。其中低温指35℃-10℃。 CD13只表达在肿瘤新生血管内皮细胞上，处于静止状态的正常血管内皮细胞很少 表达。最近的研究证实，CD13蛋白受碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)调节，选择性高表达于 1F6恶性黑色素瘤等肿瘤细胞表面，并且与肿瘤的恶性侵润和转移密切相关。我们用流式细 胞仪分析了CD13在不同细胞中的表达水平，结果表明：人微血管内皮细胞高水平表达CD13， 人宫颈癌细胞Hela肿瘤细胞CD13表达水平也较高，结肠癌细胞HCT-15表达中等量的CD13分 子，结肠癌细胞COLO-205表达极微量或不表达CD13分子。上述由CD13配体、肿瘤坏死因子相 4 CN 111548425 A 说　明　书 3/13 页 关凋亡配体组成的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体可以大大提高肿瘤坏死因 子相关凋亡配体在肿瘤组织中的分布、实现肿瘤坏死因子相关凋亡配体在肿瘤组织中的靶 向输送、大大提高肿瘤坏死因子相关凋亡配体的抗肿瘤效果、同时显著降低肿瘤坏死因子 相关凋亡配体的用量。 同时编码公开肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的cDNA，它可以通过肿 瘤坏死因子相关凋亡配体的dDNA增加编码的CD13配体和连接肽的DNA序列制备。上述组成 的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的cDNA可用于基因治疗。 本发明的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体可以通过采用聚乙二醇、脂 肪酸化、重组加上抗体Fc片段或白蛋白等方法修饰，从而延长肿瘤坏死因子相关凋亡配体 变体的半衰期，达到更好的药代动力学效果。 同已有的肿瘤坏死因子相关凋亡配体及其变体相比，本发明具有的有益效果： (1)更好的肿瘤组织靶向性：现有的肿瘤坏死因子相关凋亡配体对于肿瘤组织的 相对选择性作用主要是利用肿瘤组织表达的死亡受体4和死亡受体5来显示实现的，而本专 利发明的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体除了利用肿瘤组织表达的死亡受体4 和死亡受体5之外，还利用肿瘤组织丰富表达CD13的特点，从而更为有效地实现了肿瘤靶向 性肿瘤坏死因子相关凋亡配体在肿瘤组织的靶向输送。 (2)更为高效的抗肿瘤效果：由于实现了肿瘤坏死因子相关凋亡配体在肿瘤组织 中的靶向投递，本专利发明的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体无论是与相同剂 量的肿瘤坏死因子相关凋亡配体相比、还是与靶向于肿瘤细胞表面的整合素αVβ3、αVβ5的 TRAIL变体RGD-L-TRAIL(中国发明专利申请号：200710133862.1)相比，无论在单独使用、还 是与现有的化疗、放疗、中药治疗、生物治疗等方法联合使用时都表现出具有更好的抗肿瘤 效果。 (3)更低的使用剂量：由于肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体比相同剂 量的肿瘤坏死因子相关凋亡配体具有更好的抗肿瘤效果，因此在使用时，能够在保证相同 抗肿瘤疗效的情况下，大大降低肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体蛋白质的用 量。肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体蛋白质给药剂量的降低将能够克服肿瘤坏 死因子相关凋亡配体在肿瘤治疗中潜在的副作用，同时可以降低肿瘤患者的治疗费用，达 到高效、低毒副作用、低成本肿瘤治疗的效果。 (4)便于表达和生产：与通过肿瘤细胞特异性抗体及其抗体片段靶向的肿瘤靶向 性肿瘤坏死因子相关凋亡配体融合蛋白质不同，本专利发明将肿瘤坏死因子相关凋亡配体 与CD13的短肽配体相融合，分子量增加不大，从而更有利于肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关 凋亡配体变体的基因克隆、表达和生产，产量更高。 (5)可溶性的表达和简易的分离纯化：尽管目前肿瘤坏死因子相关凋亡配体在大 肠杆菌中表达时易形成无生物活性的包涵体产物，而本专利发明的肿瘤靶向性肿瘤坏死因 子相关凋亡配体变体的分子结构和分子量比野生型肿瘤坏死因子相关凋亡配体更为复杂， 因此在大肠杆菌中表达时，其包涵体形成将更为严重、纯化将更为复杂。本发明采用了低温 下培养和诱导表达肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的表达方法，使得表达产物 有效避免了包涵体的形成；本发明同时利用了肿瘤坏死因子相关凋亡配体具有鏊合金属离 子的生物功能，将金属亲和层析和离子交换层析方法相结合使得肿瘤靶向性肿瘤坏死因子 5 CN 111548425 A 说　明　书 4/13 页 相关凋亡配体变体得到了有效的纯化、获得了高纯度的蛋白质产物。本发明专利通过可溶 性表达和简易分离纯化方法的优化最终导致纯化产物具有高比例的聚体形式，从而保证了 获得的产物具有非常好的生物活性。生产高比例聚体形式的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关 凋亡配体变体，这是本发明与同类研究的显著区别。本发明提供了一种有效表达和高效获 得高的聚体含量的肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体的表达方法和纯化工艺。 (6)在CD13配体的N端增加一个不含支链的氨基酸，有效防止了表达时出现的N端 氨基酸出现降解，从而影响CD13配体功能的情况。 附图说明 图1.纯化的重组人肿瘤坏死因子相关凋亡配体及变体分析 1A.SDS-PAGE分析结果：1、靶向于CD13的肿瘤靶向性人肿瘤坏死因子相关凋亡配 体变体(NGR-L-TRAIL)；2、人肿瘤坏死因子相关凋亡配体；3、靶向于整合素αVβ3、αVβ5的人 肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体(RGD-L-TRAIL)； 1B.非还原、非变性PAGE分析结果：1、靶向于CD13的肿瘤靶向性人肿瘤坏死因子相 关凋亡配体变体(NGR-L-TRAIL)；2、人肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)；3、靶向于整合 素αVβ3、αVβ5的人肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体(RGD-L-TRAIL)。 图2.流式细胞仪分析绿色荧光素标记的人肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)及 其肿瘤靶向性变体(NGR-L-TRAIL)与人微血管内皮细胞的结合。 NGR-L-TRAIL及其TRAIL、RGD-L-TRAIL、小牛血清白蛋白(BSA)对照蛋白用FITC荧 光素标记。人微血管内皮细胞(HDMVEC)用1微克的标记蛋白标记1小时。 图3.COLO-205细胞表面CD13和整合素αVβ3、αVβ5的表达分析。 3A：CD13的表达分析；3B：整合素αVβ3的表达分析；3C：整合素αVβ5的表达分析。 图4.人肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)及其肿瘤靶向性变体(NGR-L-TRAIL) 诱导各种肿瘤细胞凋亡的量效关系分析。 4A、Hela细胞；4B、COLO-205细胞；4C、HCT-15细胞。 图5.分光光度法检测人肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)及其肿瘤靶向性变体 (NGR-L-TRAIL)对CD13阳性Hela细胞Caspase-8和Caspase-3酶活的影响。 5A：Caspase-8；5B：Caspase-3。 细胞分别用10～270纳克/毫升浓度梯度的肿瘤靶向性变体NGR-L-TRAIL和RGD-L- TRAIL蛋白分别处理Hela细胞8小时，诱导后细胞冰上裂解，加入荧光底物反应1小时，然后 用酶标仪检测分析(激发波长400nm，发射波长505nm)。 图6.人肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)及其肿瘤靶向性变体(NGR-L-TRAIL) 在COLO-205肿瘤模型上单独治疗以及与CPT-11联合治疗的抗肿瘤效果。 6A：人肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)及其肿瘤靶向性变体(NGR-L-TRAIL)， 以及RGD-L-TRAIL单独治疗； 6B：人肿瘤坏死因子相关凋亡配体及其变体与CPT-11联合治疗。数据统计分析结 果用平均数表示；方差为标准误；星号*表示p＜0.05；两个星号**表示p＜0.01。 图7.人肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)及其肿瘤靶向性变体(NGR-L-TRAIL) 在HT-15结肠癌肿瘤模型上单独治疗以及与CPT-11联合治疗的抗肿瘤效果。 6 CN 111548425 A 说　明　书 5/13 页 7A：人肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)及其肿瘤靶向性变体(NGR-L-TRAIL)单 独治疗； 7B：人肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)及其肿瘤靶向性变体(NGR-L-TRAIL)与 CPT-11联合治疗。数据统计分析结果用平均数表示；方差为标准误；星号*表示p＜0.05；两 个星号**表示p＜0.01。 图8.人肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)及其肿瘤靶向性变体(NGR-L-TRAIL) 在TRAIL不敏感的HT-29结肠癌肿瘤模型上单独治疗以及与CPT-11联合治疗的抗肿瘤效果。 图9.人肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)及其变体(NGR-L-TRAIL)、以及RGD-L- TRAIL在COLO-205肿瘤动物模型中在肿瘤组织的靶向富集效果比较分析。 含有COLO-205肿瘤的裸鼠分别尾静脉注射100微升/5微居125I-标记的人肿瘤坏 死因子相关凋亡配体及其肿瘤靶向性变体蛋白。在注射5、30、60、120和240分钟后，分别剥 离肿瘤组织并称重，用液闪计数仪测定肿瘤组织同位素的放射量，肿瘤组织的放射量单位 为每克组织测定放射量与注射放射量的百分比(％ID/g)，所有结果为三次独立实验的平均 值。 图10 .125I同位素标记检测的人肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)及其变体 (NGR-L-TRAIL)在动物器官组织中的分布。