技术摘要：
本发明涉及医药检测领域，尤其涉及到一种利用稳定同位素标记物作为内标测定药物浓度的质谱分析方法，更具体地说是利用霉酚酸‑D3测定多种生物样本中霉酚酸含量的质谱检测试剂及其使用方法。霉酚酸‑D3为稳定同位素(氘)标记的霉酚酸，分子质量数较霉酚酸高，质谱检测时 全部
背景技术：
霉酚酸酯(MMF)作为主要的免疫抑制剂已被广泛用于器官移植后急性排异反应的 预防和治疗。MMF口服吸收后在血浆酯酶的作用下水解为游离的活性代谢物MPA；后者通过 抑制鸟嘌呤从头合成途径中的限速酶(次黄嘌呤核苷酸脱氢酶)，选择性阻滞T和B细胞增 殖，对移植排异和自身免疫疾病均有显著的疗效。MMF的药物代谢动力学个体差异较大，其 药-时曲线下面积(AUC)与药效及不良反应相关，因此监测MPA在体内的药物浓度在临床用 药中具有重要意义。目前检测霉酚酸的常见方法有：紫外分光光度法、均相免疫分析法、高 效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等。 稳定同位素内标质谱法是将已知质量和丰度的浓缩稳定同位素作为内标物配制 成一定浓度的内标液，定量加入样品中，均匀混合，用质谱仪测定混合前后同位素丰度的变 化，由此计算出样品中该元素含量的方法。由于是根据同位素比值的测定来求含量，而比值 的测定很少受到基质效应和仪器条件变化的影响，因而该法是一种准确度和精密度高的方 法。 在现有检测霉酚酸的分析技术中，内标一般分为两种类型，即结构类似物内标(如 吲哚美辛、奈普生)和同位素内标(霉酚酸-D3)。其中同位素内标和待测物在离子化效率和 回收率上的差异更小，使用同位素作为内标的方法在精密度、准确度和稳定性上优于以结 构类似物为内标的方法。 专利文献【申请号200810202401.X】发明了同时测定人尿液中霉酚酸酯、霉酚酸及 其代谢产物的方法、专利文献【公开号CN 110376386A】中发明的试纸条，虽然操作方便，但 其准确性有待进一步验证，灵敏度低于质谱方法。专利文献【CN110554123A】“一种快速检测 全血中免疫抑制剂的方法、试剂盒及其应用”在质谱检测中使用了10ng/mL的霉酚酸同位素 内标，但对内标物的结构或其它可使用浓度没有做具体说明。目前未见报道利用霉酚酸-D3 (浓度范围2.5μg/mL～10μg/mL)测定多种生物样本中霉酚酸含量的质谱方法。
技术实现要素：
本发明的目的之一是针对现有技术的不足，提供一种利用最适宜浓度和操作的霉 酚酸-D3作为内标测定生物样本中霉酚酸含量的质谱检测试剂及其使用方法，对血液、尿 液、组织等多种生物样本中霉酚酸的浓度能够准确、稳定地监测。 本发明为解决其技术问题所采用的技术方案是： 1.一种利用霉酚酸-D3作为内标测定生物样本中霉酚酸含量的质谱检测试剂及其 3 CN 111579690 A 说 明 书 2/5 页 使用方法，其特征在于：本发明为一种含有霉酚酸-D3的质谱检测试剂及其使用方法，用于 检测生物样本中霉酚酸的含量。 2.进一步的，所述霉酚酸-D3为稳定同位素(氘)标记的霉酚酸，分子质量数较霉酚 酸高，质谱检测时能够区分两者。将霉酚酸-D3溶于甲醇、乙醇、乙腈等有机溶液，配制成浓 度范围200μg/mL～1mg/mL霉酚酸-D3内标储备液，使用前稀释至2.5μg/mL～10μg/mL。 3.进一步的，将霉酚酸标准品配制成6～8个浓度梯度的溶液(浓度范围在0.10～ 40.00μg/mL)，用于绘制标准曲线。将霉酚酸-D3作为内标，按照一定比例稀释待测样本，用 质谱方法检测。 4.进一步的，所述标准曲线是以霉酚酸校准品的实测峰面积与内标霉酚酸-D3峰 面积的比值(Y)对霉酚酸标示浓度(X)作线性回归分析、采用加权最小二乘法获得的回归方 程Y＝aX b，其中a为斜率，b为截距。 5.进一步的，从服用霉酚酸酯后的生物体内采集样本，进行样本前处理。生物样本 包括人体和动物来源的体液、细胞或组织，其中体液包括全血、血浆或血清、尿液、唾液、组 织液(脑脊液、淋巴液)等。样本前处理采用乙腈沉淀蛋白。 6.进一步的，将检测信号(待测样本中霉酚酸与霉酚酸-D3的色谱峰面积比值)代 入标准曲线方程，计算出霉酚酸含量。 本发明的优点在于： 1 .采用了稳定同位素霉酚酸-D3做内标，该化合物与霉酚酸的提取效率及绝对基 质效应非常接近，可以最大程度的减弱样本处理和检测过程效应对结果的影响。 2.多次验证时标准曲线的相关系数r>0.99，检测精密度的变异系数小于10％，准 确度大于90％，方法较为稳定。 3.采用了直接乙腈沉淀蛋白法。该方法操作简便，成本较低，耗时短；流动相中含 0.1％甲酸，有助于提高霉酚酸的离子化效率，进而提高方法的灵敏度。
本发明涉及医药检测领域，尤其涉及到一种利用稳定同位素标记物作为内标测定药物浓度的质谱分析方法，更具体地说是利用霉酚酸‑D3测定多种生物样本中霉酚酸含量的质谱检测试剂及其使用方法。霉酚酸‑D3为稳定同位素(氘)标记的霉酚酸，分子质量数较霉酚酸高，质谱检测时 全部
背景技术：
霉酚酸酯(MMF)作为主要的免疫抑制剂已被广泛用于器官移植后急性排异反应的 预防和治疗。MMF口服吸收后在血浆酯酶的作用下水解为游离的活性代谢物MPA；后者通过 抑制鸟嘌呤从头合成途径中的限速酶(次黄嘌呤核苷酸脱氢酶)，选择性阻滞T和B细胞增 殖，对移植排异和自身免疫疾病均有显著的疗效。MMF的药物代谢动力学个体差异较大，其 药-时曲线下面积(AUC)与药效及不良反应相关，因此监测MPA在体内的药物浓度在临床用 药中具有重要意义。目前检测霉酚酸的常见方法有：紫外分光光度法、均相免疫分析法、高 效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等。 稳定同位素内标质谱法是将已知质量和丰度的浓缩稳定同位素作为内标物配制 成一定浓度的内标液，定量加入样品中，均匀混合，用质谱仪测定混合前后同位素丰度的变 化，由此计算出样品中该元素含量的方法。由于是根据同位素比值的测定来求含量，而比值 的测定很少受到基质效应和仪器条件变化的影响，因而该法是一种准确度和精密度高的方 法。 在现有检测霉酚酸的分析技术中，内标一般分为两种类型，即结构类似物内标(如 吲哚美辛、奈普生)和同位素内标(霉酚酸-D3)。其中同位素内标和待测物在离子化效率和 回收率上的差异更小，使用同位素作为内标的方法在精密度、准确度和稳定性上优于以结 构类似物为内标的方法。 专利文献【申请号200810202401.X】发明了同时测定人尿液中霉酚酸酯、霉酚酸及 其代谢产物的方法、专利文献【公开号CN 110376386A】中发明的试纸条，虽然操作方便，但 其准确性有待进一步验证，灵敏度低于质谱方法。专利文献【CN110554123A】“一种快速检测 全血中免疫抑制剂的方法、试剂盒及其应用”在质谱检测中使用了10ng/mL的霉酚酸同位素 内标，但对内标物的结构或其它可使用浓度没有做具体说明。目前未见报道利用霉酚酸-D3 (浓度范围2.5μg/mL～10μg/mL)测定多种生物样本中霉酚酸含量的质谱方法。
技术实现要素：
本发明的目的之一是针对现有技术的不足，提供一种利用最适宜浓度和操作的霉 酚酸-D3作为内标测定生物样本中霉酚酸含量的质谱检测试剂及其使用方法，对血液、尿 液、组织等多种生物样本中霉酚酸的浓度能够准确、稳定地监测。 本发明为解决其技术问题所采用的技术方案是： 1.一种利用霉酚酸-D3作为内标测定生物样本中霉酚酸含量的质谱检测试剂及其 3 CN 111579690 A 说 明 书 2/5 页 使用方法，其特征在于：本发明为一种含有霉酚酸-D3的质谱检测试剂及其使用方法，用于 检测生物样本中霉酚酸的含量。 2.进一步的，所述霉酚酸-D3为稳定同位素(氘)标记的霉酚酸，分子质量数较霉酚 酸高，质谱检测时能够区分两者。将霉酚酸-D3溶于甲醇、乙醇、乙腈等有机溶液，配制成浓 度范围200μg/mL～1mg/mL霉酚酸-D3内标储备液，使用前稀释至2.5μg/mL～10μg/mL。 3.进一步的，将霉酚酸标准品配制成6～8个浓度梯度的溶液(浓度范围在0.10～ 40.00μg/mL)，用于绘制标准曲线。将霉酚酸-D3作为内标，按照一定比例稀释待测样本，用 质谱方法检测。 4.进一步的，所述标准曲线是以霉酚酸校准品的实测峰面积与内标霉酚酸-D3峰 面积的比值(Y)对霉酚酸标示浓度(X)作线性回归分析、采用加权最小二乘法获得的回归方 程Y＝aX b，其中a为斜率，b为截距。 5.进一步的，从服用霉酚酸酯后的生物体内采集样本，进行样本前处理。生物样本 包括人体和动物来源的体液、细胞或组织，其中体液包括全血、血浆或血清、尿液、唾液、组 织液(脑脊液、淋巴液)等。样本前处理采用乙腈沉淀蛋白。 6.进一步的，将检测信号(待测样本中霉酚酸与霉酚酸-D3的色谱峰面积比值)代 入标准曲线方程，计算出霉酚酸含量。 本发明的优点在于： 1 .采用了稳定同位素霉酚酸-D3做内标，该化合物与霉酚酸的提取效率及绝对基 质效应非常接近，可以最大程度的减弱样本处理和检测过程效应对结果的影响。 2.多次验证时标准曲线的相关系数r>0.99，检测精密度的变异系数小于10％，准 确度大于90％，方法较为稳定。 3.采用了直接乙腈沉淀蛋白法。该方法操作简便，成本较低，耗时短；流动相中含 0.1％甲酸，有助于提高霉酚酸的离子化效率，进而提高方法的灵敏度。
