技术摘要：
本发明提供了一种用于富集幽门螺杆菌的磁微粒偶联物、制备方法、富集方法及试剂盒，涉及生物技术领域，本发明提供的用于富集幽门螺杆菌的磁微粒偶联物，将磁珠与抗幽门螺杆菌抗体偶联，可对样本中尤其是粪便样本中的幽门螺杆菌起到有效的特异性识别及富集作用，且富集  全部
背景技术：
幽门螺杆菌是一种革兰氏阴性杆菌，镜下呈螺旋状、海鸥状，主要寄居在人体胃 部，在微需氧条件下才可生长繁殖。与慢性萎缩性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织 淋巴瘤和胃癌等发生发展密切相关，因此引起临床的广泛关注。传统的活检组织分离培养 是诊断幽门螺杆菌的金标准，但受取样部位、实验室培养条件苛刻、时间长等因素，检出率 低，不利于快速诊断且对受检者属于有创检查。免疫学检测血清中或者唾液中的抗体  (IgG)其缺点是不能及时反映出现症感染。直接检测粪便中的抗原成分阳性率和准确性不 高。宏基因组测序对设备和技术要求高、成本高且耗时长，不适用于普通实验室和临床标本 的检测，且这些方法都不能对幽门螺杆菌进行定量检测。数字PCR检测需要特定的设备和条 件，费用高昂，同样不适用于普通实验室和临床标本的检测。探针法实时定量荧光PCR技术 需要合成荧光探针，成本较高，且对样本中幽门螺杆菌的载量有一定要求。环介导等温扩增 法(loop-mediatedisothermal  amplification，LAMP)灵敏度较高，但容易受气溶胶污染， 加上目前国内大多数实验室不能严格分区，假阳性问题比较严重。 综上所述，如何快速、准确、无创地对幽门螺杆菌进行鉴定和定量分析是本领域的 技术人员迫切亟待解决的问题。
技术实现要素：
本发明的第一个目的在于提供一种用于富集幽门螺杆菌的磁微粒偶联物，以至少 缓解现有技术中存在的技术问题之一。 本发明的第二个目的在于提供上述用于富集幽门螺杆菌的磁微粒偶联物的制备 方法。 本发明的第三个目的在于提供一种富集幽门螺杆菌的方法。 本发明的第四个目的在于提供一种富集幽门螺杆菌的试剂盒。 为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案： 本发明提供了一种用于富集幽门螺杆菌的磁微粒偶联物，所述磁微粒偶联物包括 磁珠，以及与所述磁珠偶联的抗幽门螺杆菌抗体； 其中，每5mg磁珠偶联有90-110μg的抗幽门螺杆菌抗体。 进一步的，每5mg磁珠偶联有100μg的抗幽门螺杆菌抗体； 优选地，所述抗幽门螺杆菌抗体包括抗幽门螺杆菌多克隆抗体。 本发明还提供了上述的磁微粒偶联物的制备方法，包括将抗幽门螺杆菌抗体和活 化的磁珠偶联，得到所述用于富集幽门螺杆菌的磁微粒偶联物； 4 CN 111575190 A 说　明　书 2/13 页 优选地，所述活化的磁珠包括活化的羧基化磁珠； 优选地，所述羧基化磁珠的活化条件包括：每10mg羧基化磁珠用1ml  MES进行磁性 分离清洗，重复3次，移除上清后加入EDC溶液和NHS溶液，保持羧基化磁珠悬浮在状态下进 行活化，去除上清后得到活化的羧基化磁珠； 优选地，所述MES的浓度为100mM，pH为5.0； 优选地，所述EDC溶液的浓度为200mM，加入量为100μl； 优选地，所述NHS溶液的浓度为200mM，加入量为100μl； 优选地，活化的时间为30min，温度为25℃； 优选地，活化后还包括使用PBS进行清洗的步骤，然后得到活化的羧基化磁珠； 优选地，取经超声分散后的1ml浓度为10mg/ml的磁珠到1.5ml离心管中，置于磁性 分离架上，待固液分离后弃上清，用1ml  MES进行磁性分离洗涤3次，移除上清；然后加入100 μl浓度为200mM的EDC溶液与100μl  浓度为200mM的NHS溶液，漩涡混匀使磁珠充分悬浮并保 持，25℃活化  30min，用磁力架磁性分离弃上清，并用冰PBS缓冲液洗3次，于200μl  PBS  缓 冲液中重悬； 优选地，所述抗幽门螺杆菌抗体包括抗幽门螺杆菌多克隆抗体； 优选地，所述抗幽门螺杆菌多克隆抗体的制备方法包括免疫原的制备、多克隆抗 体的制备和抗体的纯化； 优选地，选择灭活的幽门螺杆菌，用PBS洗涤后将终浓度调至  107CFU/ml，得到免 疫原； 优选地，所述幽门螺杆菌为球形幽门螺杆菌、杆状幽门螺杆菌幽门螺杆菌或弯曲 状幽门螺杆菌中的一种或多种； 优选地，将幽门螺杆菌用甲醛固定37℃灭活； 优选地，用所述免疫原免疫家兔，得到抗幽门螺杆菌多克隆抗体； 优选地，每次每只家兔耳缘注射2ml免疫原； 优选地，免疫次数为四次，优选第一次免疫与第二次免疫间隔10天，第二次免疫与 第三次免疫间隔7天，第三次免疫与第四次免疫间隔7天； 优选地，所述抗体的纯化包括将兔抗血清离心后取上清，经饱和硫酸铵沉淀； 进一步的，每100μl已活化的磁珠溶液与100μl浓度为0.5-4mg/ml的抗幽门螺杆菌 抗体溶液混合进行偶联，其中每100μl活化的磁珠溶液中含有  4-6mg活化的磁珠； 优选地，所述抗幽门螺杆菌抗体溶液的浓度为1mg/ml； 优选地，每100μl已活化的磁珠溶液中含有5mg活化的磁珠。 进一步的，偶联的时间为1-3h，优选为2h； 优选地，偶联的温度为25-45℃，优选为25℃。 进一步的，偶联后还包括去除未偶联的抗幽门螺杆菌抗体的步骤，然后得到所述 用于富集幽门螺杆菌的磁微粒偶联物； 优选地，去除未偶联的抗幽门螺杆菌抗体后，还包括封闭磁微粒偶联物上剩余结 合位点的步骤，然后得到所述用于富集幽门螺杆菌的磁微粒偶联物。 本发明还提供了一种幽门螺杆菌的富集方法，包括使用上述的磁微粒偶联物富集 样本中的幽门螺杆菌。 5 CN 111575190 A 说　明　书 3/13 页 进一步的，向每1ml样本溶液中加入0.4-0.6mg磁微粒偶联物，用于富集样本中的 幽门螺杆菌； 优选向每1ml样本溶液中加入0.5mg磁微粒偶联物； 优选地，富集温度为25-45℃，优选为25-37℃，更优选为37℃； 优选地，富集时间为15-60min，优选为30-45min，更优选为30min。 进一步的，所述样本为粪便样本。 另外，本发明还提供了一种用于富集幽门螺杆菌的试剂盒，包括上述的磁微粒偶 联物； 优选地，所述试剂盒还包括阴性对照品、阳性对照品、PBS缓冲液或幽门螺杆菌核 酸定量标准品中的一种或多种。 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： 本发明提供的用于富集幽门螺杆菌的磁微粒偶联物，将磁珠与抗幽门螺杆菌抗体 偶联，可对样本中尤其是粪便样本中的幽门螺杆菌起到有效的特异性识别及富集作用，且 富集效率高，克服了直接提取粪便样品基因组的过程中其他基质组分对实验结果的影响， 和传统的胃镜取样的有创方式相比，该方法直接从检测对象的粪便中提取样品属于一种无 创取材方式，且方式简单，过程受其他因素影响较小，同时对检测对象身心创伤小，接受度 高。同时，本发明通过优化磁珠与抗幽门螺杆菌抗体的偶联量，有效提高了幽门螺杆菌的富 集率及检出率，使阳性样本的反应性与阴性样本的反应性有较高的区分度。 本发明提供的磁微粒偶联物的制备方法，将抗幽门螺杆菌抗体和活化的磁珠偶联 即可得到，该制备方法简单，成本低廉，适于大规模生产应用。 本发明提供的幽门螺杆菌的富集方法，包括使用本发明提供的磁微粒偶联物对样 本中的幽门螺杆菌进行富集，富集时间快，一般15至30分钟，且不受取材部位与培养条件的 影响，对粪便样本中的幽门螺杆菌也有高效的富集作用，从而有效避免受检者进行创伤性 采样。并且，该富集方法对设备和技术均无特殊要求，能够有效节约成本，适用于普通实验 室和临床标本的检测。 基于本发明提供的用于富集幽门螺杆菌的磁微粒偶联物的发明构思，本发明还提 供了一种用于富集幽门螺杆菌的试剂盒，包括本发明提供的磁微粒偶联物。该试剂盒同样 具有阳性样本富集率高、检测精度高的有益效果，结合现有的检测技术，在临床应用上能快 速诊断出感染者的感染剂量，为临床诊断提供有力参考。 附图说明 为了更清楚地说明本发明