技术摘要：
本发明公开了一种草鱼和青鱼肌间刺变粗的分子育种方法，属于水产生物育种技术领域。本发明的分子育种方法是基于基因编辑的技术手段，获得靶向突变草鱼和青鱼mstn基因的F0代，通过传代获得mstn缺失且肌间刺骨化面积增加的突变体个体。在本发明中，首次提出了利用基因编 全部
背景技术：
草鱼、青鱼，属于四大家鱼，在养殖过程中具有生长周期短、成活率高等特点，是我 国主要的淡水养殖鱼类，其肉质细嫩，肉味鲜美在我国淡水鱼类养殖中占据有主导地位，是 市场畅销的大宗水产品，深受广大消费者的喜爱。利用基因编辑是鱼类性状选育的重要技 术手段，通过基因编辑技术可以靶向编辑特定基因从而获得具有优良性状的新品种，对水 产业培育出养殖性能优良的品种有着重要的意义。目前，国内外很多研究者开展了通过基 因编辑技术研究养殖鱼类的体色、抗病、性腺发育等分子育种工作，这对培育优良品种具有 积极作用。 多数淡水鱼类 ，尤其是鲤科鱼类都具有一定数量的 肌间 刺 ，肌间 刺 (intermuscular bone,IB)即为肌间骨，位于脊椎骨两侧肌间隔中，是一种仅存在于低等真 骨鱼类的膜性硬骨。肌间刺不同于脊椎骨，分散在肌间隔中，对鱼肉的加工及食用造成较大 困难。目前，已有国家发明专利“一种分离脆肉草鱼鱼背肉和鱼脊骨肉的方法“(专利号： CN201110206703.6)”利用解剖将草鱼肌间刺与鱼背肉分离，但也会损失很多鱼肉；国家发 明专利“异育银鲫新品系优化选育育苗方法”(专利号：ZL201010140103.X)，利用兴国红鲤 精子作为异源精子刺激银鲫卵子雌核发育生殖产生的全雌性后代，获得的异育银鲫新品系 肌间刺减少；国家发明专利“一种生长快及少肌间刺的杂交鲂鲌的构建方法”(专利号 CN201710788633)利用三角鲂为母本与翘嘴鲌父本进行远缘杂交，获得的杂种表现出生长 快、形态优、肌间刺少且形态简单等优良性状。但是通过传统育种方法获得的品种对减少肌 间刺数量效果一般。肌肉生长抑制素mstn(myostatin)是一类在骨骼肌中广泛表达的糖蛋 白，是肌肉生长的负调控因子。目前国内外尚未有文献报道mstn基因会影响鱼类肌间刺的 骨化面积。 草鱼和青鱼是我国的常见淡水经济鱼类,其肉质鲜嫩，营养丰富,一直深受我国消 费者所青睐。我国草鱼和青鱼的养殖规模不断壮大，草鱼年总产量现已超过300万吨，青鱼 年产量超过200万吨，产量稳步持续增长，是我国重要的淡水养殖良种。但是草鱼、青鱼肌肉 中存在大量肌间刺，一定程度上影响食品加工和人们的食用。从基因层面改良鲢青鱼的形 状，增加草鱼和青鱼肌间刺面积，使人们在食用或加工草鱼和青鱼时，更容易剔除肌间刺。 降低被肌间刺伤害的风险，从而更方便人们食用草鱼和青鱼，进而有望提高市场上草鱼和 青鱼的消费量。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于采用CRISPR/Cas9的基因编辑方 法突变草鱼和青鱼的mstn基因，从而改变肌间刺大小，获得肌间刺骨化面积变大的草鱼和 4 CN 111549031 A 说 明 书 2/8 页 青鱼的方法。 为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种草鱼和青鱼肌间刺变粗的分子育种方法，步骤如下： (1)克隆草鱼和青鱼mstn基因核苷酸序列； (2)采用基因敲除方法构建草鱼和青鱼mstn基因的缺失突变体品系； (3)筛选肌间刺粗大个体：选取经过基因敲除后比同龄野生种肌肉肥大的草鱼和 青鱼分别进行杂交，收集受精卵，孵化培育后获得稳定遗传的纯合突变体，检测肌间刺变化 并筛选肌间刺粗大个体。 在上述方案的基础上，所述步骤1)中克隆的草鱼mstn基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，克隆的青鱼mstn基因核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。 SEQ ID NO:1草鱼mstn基因核苷酸序列 SEQ ID NO:2青鱼mstn基因核苷酸序列 5 CN 111549031 A 说 明 书 3/8 页 6 CN 111549031 A 说 明 书 4/8 页 在上述方案的基础上，所述步骤1)中克隆草鱼mstn基因核苷酸序列的引物对为： F:5’-GTGTATTAATTGCATGTGGTCC-3’(SEQ ID NO:3)； R:5’-GCTGTTACAGCAAAGATATAAATG-3’(SEQ ID NO:4)； 所述步骤1)中克隆青鱼mstn基因核苷酸序列的引物对为： F:5’-TGCATGTGGTCCAGTGGGTTATG-3’(SEQ ID NO:5)； R:5’-CTCTTTGCCGTTGAAGTAAAG-3’(SEQ ID NO:6)； 在上述方案的基础上，步骤(2)所述的基因敲除方法为TALEN法或crispr/cas9法。 在上述方案的基础上，采用CRISPR/Cas9基因敲除方法构建草鱼和青鱼mstn基因 的缺失突变体品系的方法，具体为： ①在草鱼和青鱼mstn基因序列的外显子区域设计靶点，将设计的靶点体外转录合 成sgRNA，并与Cas9 mRNA按比例混合，配成用于基因编辑注射的药物； ②取性腺发育成熟的草鱼和青鱼，注射促黄体激素释放素类似物LRH-A，间隔1～3 天后进行人工授精，待胚胎吸水膨胀后开始注射①中的基因编辑注射药物，注射时将药物 准确注射到一细胞期的细胞内，每个胚胎注射体积约2nL； ③注射完成后随机抽取三组注射12h后的草鱼和青鱼胚胎，每组三颗，用剪刀剪碎 胚胎，提取基因组DNA，用荧光毛细管电泳法检测敲除效率； ④将检测有效的胚胎饲养至1个月，剪取个体尾鳍，提取基因组DNA，进行荧光STR 检测，再通过分子克隆确定突变基因型，将编辑数目非3n的有效突变F0代留下，将有效突变 的草鱼和青鱼饲养至成年。 在上述方案的基础上，所述步骤①中基因编辑注射的药物含Cas9 mRNA终浓度 300ng/μL，sgRNA终浓度50ng/μL。 在上述方案的基础上，所述步骤①设计的草鱼mstn基因敲除靶点序列为以下序列 中的至少一条： 在第一个外显子上设计的4个靶点，序列为： 7 CN 111549031 A 说 明 书 5/8 页 exon1-target1:5’-GGTTCTGGGGGATGACAGTA-3’(SEQ ID NO:7)； exon1-target2:5’-GGTCATGATGGTCTCTGTGG-3’(SEQ ID NO:8)； exon1-target3:5’-GGGTTGTCTGAACTCACATG-3’(SEQ ID NO:9)； exon1-target4:5’-GGAGCCTTCCACAGCCACGG-3’(SEQ ID NO:10)； 在第二个外显子上设计的3个靶点，序列为： exon2-target1:5’-GGGTGGTGTGATCAGATGTC-3’(SEQ ID NO:11)； exon2-target2:5’-GGTGGTGTGATCAGATGTCC-3’(SEQ ID NO:12)； exon2-target3:5’-GGGACGCTCACTCACTCTCT-3’(SEQ ID NO:13)； 所述步骤①设计的青鱼mstn基因敲除靶点序列为以下序列中的至少一条： 在第一个外显子上设计的4个靶点，序列为： exon1-target1:5’-GGTTCTGGGGGATGACAGTA-3’(SEQ ID NO:14)； exon1-target2:5’-GGGATCAGTACGATGTTCTG-3’(SEQ ID NO:15)； exon1-target3:5’-GGAGCCTTCCACAGCCACGG-3’(SEQ ID NO:16)； exon1-target4:5’-GGTCATGATGGTCTCTGTGG-3’(SEQ ID NO:17)。 在上述方案的基础上，所述步骤③中草鱼检测所用引物为： T1:5’-GTGTATTAATTGCATGTGGTCC-3’(SEQ ID NO:18)； T2:5’-GCTGTTACAGCAAAGATATAAATG-3’(SEQ ID NO:19)； 所述步骤③中青鱼检测所用引物为： T1:5’-TGCATGTGGTCCAGTGGGTTATG-3’(SEQ ID NO:20)； T2:5’-GCTTCCATGTTCAGCGTGC-3’(SEQ ID NO:21)。 在上述方案的基础上，步骤②所述的注射促黄体激素释放素类似物LRH-A的注射 用量为：10ug/kg。 在上述方案的基础上，所述步骤(3)中检测肌间刺变化的方法为鱼类硬骨染色和 体外分离肌间刺，其中硬骨染色采用茜素红染色法。 本发明的有益效果是： 在本发明中，相较于现有的通过雌核发育等传统育种方法减少肌间刺数量，本发 明通过基因编辑技术定向编辑草鱼和青鱼mstn基因，获得肌间刺骨化面积增加并且生长速 度更快、稳定遗传的突变体草鱼和青鱼，可以解决生产上因肌间刺细小难以发现从而剔除 的缺点，通过基因敲除方法，可以获得大量可稳定遗传的突变体草鱼和青鱼，更受大众欢 迎。
本发明公开了一种草鱼和青鱼肌间刺变粗的分子育种方法，属于水产生物育种技术领域。本发明的分子育种方法是基于基因编辑的技术手段，获得靶向突变草鱼和青鱼mstn基因的F0代，通过传代获得mstn缺失且肌间刺骨化面积增加的突变体个体。在本发明中，首次提出了利用基因编 全部
背景技术：
草鱼、青鱼，属于四大家鱼，在养殖过程中具有生长周期短、成活率高等特点，是我 国主要的淡水养殖鱼类，其肉质细嫩，肉味鲜美在我国淡水鱼类养殖中占据有主导地位，是 市场畅销的大宗水产品，深受广大消费者的喜爱。利用基因编辑是鱼类性状选育的重要技 术手段，通过基因编辑技术可以靶向编辑特定基因从而获得具有优良性状的新品种，对水 产业培育出养殖性能优良的品种有着重要的意义。目前，国内外很多研究者开展了通过基 因编辑技术研究养殖鱼类的体色、抗病、性腺发育等分子育种工作，这对培育优良品种具有 积极作用。 多数淡水鱼类 ，尤其是鲤科鱼类都具有一定数量的 肌间 刺 ，肌间 刺 (intermuscular bone,IB)即为肌间骨，位于脊椎骨两侧肌间隔中，是一种仅存在于低等真 骨鱼类的膜性硬骨。肌间刺不同于脊椎骨，分散在肌间隔中，对鱼肉的加工及食用造成较大 困难。目前，已有国家发明专利“一种分离脆肉草鱼鱼背肉和鱼脊骨肉的方法“(专利号： CN201110206703.6)”利用解剖将草鱼肌间刺与鱼背肉分离，但也会损失很多鱼肉；国家发 明专利“异育银鲫新品系优化选育育苗方法”(专利号：ZL201010140103.X)，利用兴国红鲤 精子作为异源精子刺激银鲫卵子雌核发育生殖产生的全雌性后代，获得的异育银鲫新品系 肌间刺减少；国家发明专利“一种生长快及少肌间刺的杂交鲂鲌的构建方法”(专利号 CN201710788633)利用三角鲂为母本与翘嘴鲌父本进行远缘杂交，获得的杂种表现出生长 快、形态优、肌间刺少且形态简单等优良性状。但是通过传统育种方法获得的品种对减少肌 间刺数量效果一般。肌肉生长抑制素mstn(myostatin)是一类在骨骼肌中广泛表达的糖蛋 白，是肌肉生长的负调控因子。目前国内外尚未有文献报道mstn基因会影响鱼类肌间刺的 骨化面积。 草鱼和青鱼是我国的常见淡水经济鱼类,其肉质鲜嫩，营养丰富,一直深受我国消 费者所青睐。我国草鱼和青鱼的养殖规模不断壮大，草鱼年总产量现已超过300万吨，青鱼 年产量超过200万吨，产量稳步持续增长，是我国重要的淡水养殖良种。但是草鱼、青鱼肌肉 中存在大量肌间刺，一定程度上影响食品加工和人们的食用。从基因层面改良鲢青鱼的形 状，增加草鱼和青鱼肌间刺面积，使人们在食用或加工草鱼和青鱼时，更容易剔除肌间刺。 降低被肌间刺伤害的风险，从而更方便人们食用草鱼和青鱼，进而有望提高市场上草鱼和 青鱼的消费量。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于采用CRISPR/Cas9的基因编辑方 法突变草鱼和青鱼的mstn基因，从而改变肌间刺大小，获得肌间刺骨化面积变大的草鱼和 4 CN 111549031 A 说 明 书 2/8 页 青鱼的方法。 为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种草鱼和青鱼肌间刺变粗的分子育种方法，步骤如下： (1)克隆草鱼和青鱼mstn基因核苷酸序列； (2)采用基因敲除方法构建草鱼和青鱼mstn基因的缺失突变体品系； (3)筛选肌间刺粗大个体：选取经过基因敲除后比同龄野生种肌肉肥大的草鱼和 青鱼分别进行杂交，收集受精卵，孵化培育后获得稳定遗传的纯合突变体，检测肌间刺变化 并筛选肌间刺粗大个体。 在上述方案的基础上，所述步骤1)中克隆的草鱼mstn基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，克隆的青鱼mstn基因核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。 SEQ ID NO:1草鱼mstn基因核苷酸序列 SEQ ID NO:2青鱼mstn基因核苷酸序列 5 CN 111549031 A 说 明 书 3/8 页 6 CN 111549031 A 说 明 书 4/8 页 在上述方案的基础上，所述步骤1)中克隆草鱼mstn基因核苷酸序列的引物对为： F:5’-GTGTATTAATTGCATGTGGTCC-3’(SEQ ID NO:3)； R:5’-GCTGTTACAGCAAAGATATAAATG-3’(SEQ ID NO:4)； 所述步骤1)中克隆青鱼mstn基因核苷酸序列的引物对为： F:5’-TGCATGTGGTCCAGTGGGTTATG-3’(SEQ ID NO:5)； R:5’-CTCTTTGCCGTTGAAGTAAAG-3’(SEQ ID NO:6)； 在上述方案的基础上，步骤(2)所述的基因敲除方法为TALEN法或crispr/cas9法。 在上述方案的基础上，采用CRISPR/Cas9基因敲除方法构建草鱼和青鱼mstn基因 的缺失突变体品系的方法，具体为： ①在草鱼和青鱼mstn基因序列的外显子区域设计靶点，将设计的靶点体外转录合 成sgRNA，并与Cas9 mRNA按比例混合，配成用于基因编辑注射的药物； ②取性腺发育成熟的草鱼和青鱼，注射促黄体激素释放素类似物LRH-A，间隔1～3 天后进行人工授精，待胚胎吸水膨胀后开始注射①中的基因编辑注射药物，注射时将药物 准确注射到一细胞期的细胞内，每个胚胎注射体积约2nL； ③注射完成后随机抽取三组注射12h后的草鱼和青鱼胚胎，每组三颗，用剪刀剪碎 胚胎，提取基因组DNA，用荧光毛细管电泳法检测敲除效率； ④将检测有效的胚胎饲养至1个月，剪取个体尾鳍，提取基因组DNA，进行荧光STR 检测，再通过分子克隆确定突变基因型，将编辑数目非3n的有效突变F0代留下，将有效突变 的草鱼和青鱼饲养至成年。 在上述方案的基础上，所述步骤①中基因编辑注射的药物含Cas9 mRNA终浓度 300ng/μL，sgRNA终浓度50ng/μL。 在上述方案的基础上，所述步骤①设计的草鱼mstn基因敲除靶点序列为以下序列 中的至少一条： 在第一个外显子上设计的4个靶点，序列为： 7 CN 111549031 A 说 明 书 5/8 页 exon1-target1:5’-GGTTCTGGGGGATGACAGTA-3’(SEQ ID NO:7)； exon1-target2:5’-GGTCATGATGGTCTCTGTGG-3’(SEQ ID NO:8)； exon1-target3:5’-GGGTTGTCTGAACTCACATG-3’(SEQ ID NO:9)； exon1-target4:5’-GGAGCCTTCCACAGCCACGG-3’(SEQ ID NO:10)； 在第二个外显子上设计的3个靶点，序列为： exon2-target1:5’-GGGTGGTGTGATCAGATGTC-3’(SEQ ID NO:11)； exon2-target2:5’-GGTGGTGTGATCAGATGTCC-3’(SEQ ID NO:12)； exon2-target3:5’-GGGACGCTCACTCACTCTCT-3’(SEQ ID NO:13)； 所述步骤①设计的青鱼mstn基因敲除靶点序列为以下序列中的至少一条： 在第一个外显子上设计的4个靶点，序列为： exon1-target1:5’-GGTTCTGGGGGATGACAGTA-3’(SEQ ID NO:14)； exon1-target2:5’-GGGATCAGTACGATGTTCTG-3’(SEQ ID NO:15)； exon1-target3:5’-GGAGCCTTCCACAGCCACGG-3’(SEQ ID NO:16)； exon1-target4:5’-GGTCATGATGGTCTCTGTGG-3’(SEQ ID NO:17)。 在上述方案的基础上，所述步骤③中草鱼检测所用引物为： T1:5’-GTGTATTAATTGCATGTGGTCC-3’(SEQ ID NO:18)； T2:5’-GCTGTTACAGCAAAGATATAAATG-3’(SEQ ID NO:19)； 所述步骤③中青鱼检测所用引物为： T1:5’-TGCATGTGGTCCAGTGGGTTATG-3’(SEQ ID NO:20)； T2:5’-GCTTCCATGTTCAGCGTGC-3’(SEQ ID NO:21)。 在上述方案的基础上，步骤②所述的注射促黄体激素释放素类似物LRH-A的注射 用量为：10ug/kg。 在上述方案的基础上，所述步骤(3)中检测肌间刺变化的方法为鱼类硬骨染色和 体外分离肌间刺，其中硬骨染色采用茜素红染色法。 本发明的有益效果是： 在本发明中，相较于现有的通过雌核发育等传统育种方法减少肌间刺数量，本发 明通过基因编辑技术定向编辑草鱼和青鱼mstn基因，获得肌间刺骨化面积增加并且生长速 度更快、稳定遗传的突变体草鱼和青鱼，可以解决生产上因肌间刺细小难以发现从而剔除 的缺点，通过基因敲除方法，可以获得大量可稳定遗传的突变体草鱼和青鱼，更受大众欢 迎。
