技术摘要：
本发明提供一株广谱溶藻放线菌LW9、分离方法及应用，该放线菌属链霉菌属，分类命名为Streptomyces filipinensis LW9，保藏编号为CCTCC NO：M 2018138。本发明筛选分离出的广谱溶藻放线菌LW9产生的溶藻物质化学性质稳定，对酸碱、高温及紫外条件不敏感，可长时间发挥溶  全部
背景技术：
蓝藻水华广泛存在于淡水生态系统中并产生一系列严重的水环境问题，对人类健 康和生态系统造成严重危害，而微囊藻水华是世界范围内规模性和危害性最大的一类蓝藻 水华。目前针对治理水体富营养化的物理化学方法具有治理成本高，易对环境产生二次污 染等缺点；而微生物除藻主要是利用一些能够裂解藻的微生物抑杀引发水体富营养化现象 的藻类，具有来源广泛、培养成本低、对环境安全友好等特征，发展应用前景广阔。 放线菌是一类具开发经济价值天然活性物质的重要微生物资源，溶藻放线菌为微 生物控藻和研发新型生物控藻剂提供广阔前景。如姜红等从土壤中分离得到一株高效稳定 的溶藻放线菌AN02菌株，其胞外代谢产物对铜绿微囊藻有强烈的抑制作用；又如唐晨通过 喷雾干燥将AN02菌株发酵上清液制备成一种溶藻放线菌粉剂，此粉剂按0.01%质量比投加4  d后对铜绿微囊藻的溶藻效率可达90%；还如崔妍等从江苏海洋滩涂土壤中筛选到一株具有 溶藻活性的灰霉素链霉菌，可裂解包括微囊藻、鱼腥藻和集胞藻在内的多种藻类。 目前大部分的溶藻菌研究主要集中在微囊藻溶藻细菌的筛选及溶藻特性研究方 面，而对束丝藻、鱼腥藻、颤藻等丝状蓝藻水华种类的溶藻菌发现相对较少；而且以往分离 到的大多数溶藻菌仅对单细胞状态的微囊藻具有溶藻效果，而对自然环境水体下的群体微 囊藻溶藻效果甚微。本研究通过从土壤中分离出一株具有高效广谱溶藻作用的放线菌LW9， 对其进行了形态及分子生物学鉴定，并对其溶藻物质稳定性、产生时期以及对常见水华蓝 藻种类的作用范围等溶藻特性进行了初步探究，并直接采集养殖水体微囊藻水华检验其溶 藻效果与时效，以期评价该菌在研制控藻菌剂方面的潜力，从而为蓝藻水华防治提供新方 法技术参考。
技术实现要素：
为克服目前有关溶藻菌研究的局限性以及现有溶藻菌对自然水体水华溶藻效果 甚微的问题，本发明的目的是提供一株广谱溶藻放线菌LW9、分离方法及应用。 为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下： 方案之一是提供一株广谱溶藻放线菌LW9，该放线菌属链霉菌 属，分类命名为Streptomyces  filipinensis  LW9，保藏编号为CCTCC  NO：M  2018138， 于2018年03月16日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国湖北省武汉市武汉大 学。 所述广谱溶藻放线菌LW9生物学特征如下：（1）在高氏一号培养基上菌落呈黄色、 直径5~6  mm、圆形、中央隆起状，菌落表面有小水珠，产黄色色素，菌苔的单个菌落之间有明 显的缝隙，不产孢子；（2）在葡萄糖酵母膏培养基上菌落表面为白色、背面褐色，菌落直径7~ 8  mm、圆形、中央略微隆起、周边呈花瓣状褶皱，产褐色色素，菌苔连成一片，单个菌落之间 3 CN 111575219 A 说　明　书 2/7 页 没有缝隙，产白色孢子；（3）在葡萄糖天门冬素培养基上菌落呈淡黄色、直径4~5  mm、圆形、 扁平、菌落边缘有匍匐状菌丝，菌苔的单个菌落之间有明显缝隙，产少量白色孢子；（4）在蔗 糖察氏培养基上菌落呈淡黄色、直径4~5  mm、圆形、隆起、边界明显圆滑，菌苔的单个菌落之 间有明显缝隙，产少量白色孢子。 方案之二是提供广谱溶藻放线菌LW9的分离方法，包括如下步骤： （1）采样：采用随机五点采样法，取距离地表3-5  cm深的土壤，将其均匀混合后装入无 菌袋中并带回实验室，自然风干后研成粉末，然后取10  g土壤样品，放入装有适量玻璃珠和 无菌水的锥形瓶中，振荡20  min，使泥土与无菌水充分混合； （2）恒温培养：采用梯度稀释平板涂布法将步骤（1）的土壤悬液涂布至固体高氏一号培 养基上，然后置于恒温培养箱在28℃下培养8天； （3）分离纯化：从经过步骤（2）恒温培养的培养基上挑取不同形态放线菌菌落，并以“Z” 字划线法反复分离纯化3-4次；  （4）斜面培养：将经过步骤（3）分离纯化后的单菌落接种至高氏一号试管斜面上，于28 ℃下培养7天，然后保存于4℃冰箱备用； （5）发酵培养：将经过步骤（4）处理得到的菌种接种至高氏一号液体培养基中，于28℃、 180  r/min下摇床振荡培养7天； （6）初筛：采用双层藻平板法，取对数生长期的铜绿微囊藻（Microcystis  aeruginosa） FACHB  905藻液以体积比为1：1加入到冷却至50℃、琼脂浓度2%的BG-11固体培养基中，混匀 后倒入到底层为已凝固的、琼脂浓度为1%的BG-11固体培养基平板上，使其在上层迅速均匀 铺平冷却，于25℃、25  µmol  m-2s-1光照条件下培养5  天；然后使用1  ml的无菌枪头顶端在 双层藻平板中央打圆形孔，向孔中加入经步骤（5）处理得到的放线菌发酵液100  µL，置于光 照培养箱25℃、25  µmol  m-2s-1条件下共培养5 天，观察是否产生溶藻圈； （7）复筛：将初筛得到的放线菌发酵液以体积比为5%的比例加入到Ma.  FACHB  905对数 生长期的藻液中，空白对照组加入等体积无菌水，于25℃、25  µmol  m-2s-1条件下培养3-5  天，观察藻液是否产生黄化现象。 方案之三是提供广谱溶藻放线菌LW9在蓝藻水华消亡，尤其是微囊藻水华消亡中 的应用。 进一步，广谱溶藻放线菌LW9在蓝藻水华消亡，尤其是微囊藻水华消亡中应用时， 添加的是体积比为2.5%-5%的发酵9天的LW9发酵液。 本发明的有益效果是： （1）本发明筛选分离出的广谱溶藻放线菌LW9产生的溶藻物质化学性质稳定，对酸碱、 高温及紫外条件不敏感，可长时间发挥溶藻作用； （2）本发明筛选分离出的广谱溶藻放线菌LW9产生的溶藻活性物质不仅能够溶解室内 培养的单细胞微囊藻，对群体微囊藻及常见丝状水华蓝藻束丝藻、颤藻也均有溶藻作用，具 有较好的杀藻广谱性； （3）添加2.5%-5%LW9发酵液对养殖水体水华微囊藻有持续稳定的去除效果，溶藻效果 保持稳定21天以上，具有研发成环境友好型生物控藻剂的潜力； （4）本发明筛选分离出的广谱溶藻放线菌LW9为蓝藻水华防治方面提供了新的技术参 考。 4 CN 111575219 A 说　明　书 3/7 页 附图说明 图1为本发明放线菌菌株LW9的溶藻效果（其中：A.菌株LW9在双层藻平板上形成抑 藻圈；B.菌株LW9溶解藻液：CK:对照组，T：处理组）； 图2为本发明放线菌菌株LW9在不同培养基上的形态特征（其中：A为高氏一号培养基培 养的LW9菌落形态；B为高氏一号培养基培养的LW9菌苔特征；C为葡萄糖酵母膏培养基培养 的LW9菌落形态；D为葡萄糖酵母膏培养基培养的LW9菌苔特征；E为葡萄糖天门冬素培养基 培养的LW9菌落形态；F为葡萄糖天门冬素培养基培养的LW9菌苔特征；G为蔗糖察氏培养基 培养的LW9菌落形态；H为蔗糖察氏培养基培养的LW9菌苔特征） 图3 为基于16S  rRNA基因序列的菌株LW9系统发育树； 图4为不同处理条件下菌株LW9溶藻物质的稳定性测定结果（其中，CK.空白对照；A.未 处理；B.pH  3.5酸处理；C.pH  9.5碱处理；D.热处理；E.紫外线照射处理）； 图5为菌株LW9在不同生长时期的溶藻效果； 图6为菌株LW9发酵上清液对5株水华蓝藻溶藻效果（其中A:溶藻宏观照片，CK为对照 组，T为处理组；B为溶藻显微照片）； 图7为菌株LW9发酵上清液对铜绿微囊藻TH1701细胞内部结构影响 （A.对照组；B.实验 组；a.细胞壁；b.胶被；c.伪空胞；d.类囊体）； 图8为添加不同比例LW9发酵液对养殖水体微囊藻水华的杀灭效果（A、B、C分别表示对 照组、添加LW9发酵液5%实验组、添加LW9发酵液2.5%实验组，1、2、3分别表示培养第7、14、21 天溶藻效果）； 图9为添加不同比例LW9发酵液对养殖水体水华微囊藻的溶藻效果显微观察（A、B、C分 别表示对照组、添加LW9发酵液5%实验组、添加LW9发酵液2.5%实验组，1、2、3分别表示培养 第7、14、21天观察结果）； 图10为添加不同比例LW9发酵液对养殖水体微囊藻水华的去除效果。