技术摘要：
本发明实施例公开了一种抑制NK细胞KIR 2DL3受体表达的siRNA及其应用，属于生物技术领域。所述siRNA序列为2DL3‑1或/和2DL3‑2，其中，2DL3‑1的正义链如SEQ ID NO.9所示，反义链如SEQ ID NO.10所示；2DL3‑2的正义链如SEQ ID NO.11所示，反义链如SEQ ID NO.12所示。本  全部
背景技术：
干细胞和免疫细胞是现代医学最热点的前沿技术领域，可以说，现代医学的重大 疾病、常见疾病、慢性疾病、衰老与退化性疾病的治疗，没有这两个细胞的参与，将很难有飞 跃性的进步。其中免疫细胞是人体免疫学的功能主体，在免疫系统中发挥支柱的作用。自然 杀伤细胞(NK细胞)是细胞免疫的重要成员，也是先天免疫的重要组成部分，由于其发挥先 天免疫、基础免疫、免疫调节的重要作用，而且在发挥作用时不需要预先活化，所以，在人体 免疫系统功能发挥中占有重要一席，在免疫学领域临床应用中得到业界的高度重视。 近年来，NK细胞受到业界的高度重视，在癌症预防、肿瘤免疫治疗、健康管理和抗 衰老等方面应用得到青睐。NK细胞发挥先天免疫、基础免疫的重要作用；而且在发挥作用时 不需要预先活化，能在病原侵入人体的第一时间及时消灭和清除病原，避免引起疾病；也能 在体内不需要预警、指示、动员等过程而直接杀死变异、癌变、衰老退化的细胞，是人体前沿 防御、维持内环境稳定、免疫系统协同作战的重要组成部分。由于NK细胞的上述功能角色和 作用特点，其能发挥很好的便捷、广谱、非特异作用，但随之出现的缺陷是非特异性、针对性 作用相对较弱，尤其是在病毒性疾病、恶性疾病等治疗中，时常表现出作用力不足、疗效不 确定等问题。 杀伤免疫球蛋白样受体(killer  immunoglobulin-like  receptors，KIR)是免疫 球蛋白样超家族的成员，是NK细胞上的抑制性调节通路，可抑制NK活化和裂解活性。KIR受 体是一个家族，有18个成员，分别是KIR  1D、KIR  2DL1-5、KIR  2DS1-5、KIR  3DL1-3、KIR  3DS1、假基因xv、x和KIR  2DP1。依据目前国际KIR基因命名方法，KIR基因中的D代表其胞外 结构中的Ig样结构，2D、3D代表胞外有2个或3个Ig样结构，L和S代表胞内尾段的长短，置于 命名的末尾，后面的数字表示各个不同的成员。研究表明，通过调节KIR受体通路活性，可以 提高NK细胞杀伤功能。 现有技术记载KIR受体封闭策略，主要通过抗体技术实现，具有操作方便、封闭效 果好的优点。但细胞与抗体的铰链，造成这种策略的应用中容易出现以下缺陷：(1)携带抗 体的NK细胞反复输注有一定的免疫副作用，产生异常免疫反应或发热等；(2)铰链抗体的NK 细胞已经失去了其自然的特点，进入体内很容易被人体免疫识别为病态细胞而被杀死，或 也会诱导身体异常免疫反应。 RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA (double-stranded  RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技 术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，并且副作用会很弱，所以该技术已被广泛用于 探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。 目前，通过KIR受体RNA干扰的技术活化NK细胞的专利只涉及到KIR3DL1的活化，主 3 CN 111575287 A 说　明　书 2/16 页 要用于抗艾滋病的研究中。研究表明，KIR  2DL3基因表达频率在中国人是63.0％，覆盖了多 数个体，，KIR  2DL2基因表达频率是47.8％，KIR  2DL3基因表达频率是63.0％，三个基因表 达可以覆盖所有中国人，可以通过检测三种KIR受体表达与否和表达强度，选择其中一种 KIR基因进行干扰沉默。因此，本研发团队对上述三个基因沉默技术进行研究，以开展针对 三个基因分别调控的研究领域应用。
技术实现要素：
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案： 根据本发明实施例的第一方面，本发明提供了一种抑制NK细胞KIR2DL3受体表达 的siRNA，所述siRNA序列为2DL3-1或/和2DL3-2，其中，2DL3-1的正义链如SEQ  ID  NO .9所 示，反义链如SEQ  ID  NO .10所示；2DL3-2的正义链如SEQ  ID  NO .11所示，反义链如SEQ  ID  NO.12所示。 根据本发明实施例的第二方面，本发明提供了一种重组腺病毒，包含上述的抑制 NK细胞KIR  2DL3受体表达的siRNA。 根据本发明实施例的第三方面，本发明提供了一种上述的重组腺病毒的构建方 法，包括以下步骤： S1、合成含上述siRNA序列的DNA单链，退火形成带有粘性末端的双链片段； S2、将目标基因克隆到pShuttle-H1穿梭载体中，经与pAd-Easy骨架载体共转染大 肠杆菌BJ5183感受态细胞，使其在BJ5183内进行同源重组，构建包含目的基因的重组腺病 毒质粒； S3、将重组腺病毒质粒由PacI酶切后，经脂质体介导，转染293细胞，包装后获得重 组腺病毒。 根据本发明实施例的第四方面，本发明提供上述的重组腺病毒在制备抗病毒和抗 肿瘤药物中的应用。 本发明实施例具有如下优点： 本发明的siRNA能明显特异性抑制KIR  2DL3受体表达，可使NK细胞激活，杀伤活性 显著增强，能够有效应用于抗病毒和抗肿瘤的防治中。 附图说明 为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方 式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅 仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据 提供的附图引伸获得其它的实施附图。 图1为pShuttle-H1穿梭质粒结构示意图； 图2为PCR鉴定结果； 图3为pShuttle-H1-D1-1的测序结果与目的片段对照； 图4-1为2～20号重组质粒电泳图，图4-2为1～4号重组质粒电泳图； 图5为重组腺病毒质粒PacI鉴定结果； 图6为基因组DNA鉴定结果； 4 CN 111575287 A 说　明　书 3/16 页 图7为氯化铯梯度离心示意图； 图8为荧光标记的含有目的siRNA片断的病毒质粒转染NK细胞的情况； 图9为目标基因RNA干扰后24小时结果，NK细胞对靶细胞的杀伤作用变化； 图10为目标基因RNA干扰后48小时结果，NK细胞对靶细胞的杀伤作用变化。