技术摘要：
本发明涉及一种与牛妊娠相关糖蛋白1(bovine Pregnancy‑associated glycoprotein 1，bPAG1)特异性结合的抗体或其抗原结合片段；产生所述抗体的杂交瘤细胞；包括所述抗体作为有效成分的用于诊断牛妊娠的组合物；用于诊断牛妊娠的试剂盒；以及诊断牛妊娠的方法。由于所述  全部
背景技术：
在作为工业动物的牛的饲养中，农家收入主要通过生产小牛来实现。另一方面，在 繁殖牛时，进行受孕很重要，但如果早期诊断出受精的牛是否怀孕，则可以在早期阶段对非 受孕动物进行单独管理并减少空怀期间，从而也可以降低农家成本。目前，大多数的牛妊娠 通过兽医或人工授精师在怀孕30天到42天之间进行的胎膜触诊法来诊断。另外，还有一种 使用放射免疫分析法(radiommunoassay，RIA)检测牛奶中孕酮的方法。根据该方法，孕酮为 妊娠的正常进展和维持所需的类固醇类激素，由于孕酮的血清滴度在孕早期升高，因此可 以确认牛奶中所述激素的增加程度。然而，所述放射免疫分析法的问题在于，不仅因为使用 放射性物质而具有危险性，还需要使用复杂的实验设备，并由于每头牛的孕酮含量不同且 标准不清楚，因此至少需要进行两次实验才能进行准确诊断。因此，除了解决现有问题外， 还需要开发一种新的方法，以使得可以在早期阶段更轻松快速地准确诊断牛的怀孕。
技术实现要素：
技术问题 本发明一方面提供一种与牛妊娠相关糖蛋白1(bovine  Pregnancy-associated  glycoprotein  1，bPAG1)特异性结合的抗体或其抗原结合片段。 本发明另一方面提供一种产生与bPAG1特异性结合的抗体或其抗原结合片段的杂 交瘤细胞(保藏号为KCLRF-BP-00416)。 本发明另一方面提供一种组合物，其包括与bPAG1特异性结合的抗体或其抗原结 合片段。 本发明另一方面提供一种用于诊断牛妊娠的试剂盒，其包括上述组合物。 本发明另一方面提供一种诊断牛妊娠的方法，其包括：将与bPAG1特异性结合的抗 体或其抗原结合片段与受试体试料接触；以及检测与所述抗体或抗原结合片段结合的 bPAG1。 技术方案 本发明人通过制备产生与牛妊娠血浆蛋白bPAG1特异性结合的新型单克隆抗体的 杂交瘤细胞，从所述细胞中分离并纯化所述大量抗体，使用相对简单的方法确认牛是否怀 孕来完成本发明。 在本说明书中，术语“牛妊娠相关糖蛋白1(bovine  Pregnancy-associated  glycoprotein  1，bPAG1)”为牛妊娠血浆蛋白，其统指随着怀孕而出现或增加的血流蛋白。 3 CN 111587252 A 说　明　书 2/10 页 所述bPAG1包括蛋白质的天然形式、其变体及其功能等同物。所述bPAG1可以从天然细胞或 重组细胞中分离，也可以人工合成。 在本说明书中，术语“抗体”是指与单个抗原位点特异性结合的抗体。除非另有说 明，否则所述抗体可以为包括由本领域已知的重链多肽和轻链多肽形成的抗原结合特异性 位点的分子或其抗原结合片段。所述抗体可以由浆细胞(plasma  cell)或杂交瘤细胞产生。 所述抗体可以为单克隆抗体(monoclonal  antibody)。具体地，其可以为与由保藏号为 KCLRF-BP-00416的杂交瘤细胞产生的bPAG1特异性结合的单克隆抗体。在本说明书中，术语 “抗原-抗体复合体”是指bPAG1和将其识别的抗体的结合物。所述复合体可用于检测试料中 的bPAG1。所述复合体可用于例如检测生物试料(如牛的尿、血清或血浆)中的bPAG1。 本发明一方面提供一种与bPAG1特异性结合的抗体或其抗原结合片段。具体地，根 据本发明的抗体可以包括抗原结合片段，只要所述抗体可以选择性地识别牛妊娠血浆蛋白 bPAG1即可，并且所述抗原结合片段可以包括F(ab')2、Fab、Fab、Fv片段等。 在一实施例中，通过分析与针对bPAG1的单克隆抗体特异性结合的表位(epitope) 的结果，可以确认与所述抗原特异性结合的抗体的量根据抗原的浓度而增加。尤其，在相同 的抗原浓度下，与具有序列号2至4的氨基酸序列的多肽相比，所述抗体与具有序列号1的氨 基酸序列的多肽的特异性结合量明显更高。因此，与所述bPAG1特异性结合的抗体可以与具 有序列号1的氨基酸序列的表位多肽结合。另外，所述抗体的完整形式为具有两个全长轻链 和两个全长重链的结构，并且每个轻链与重链可以通过二硫键连接。所述重链可以为包括 可变区结构域VH和三个恒定区结构域CH1、CH2和CH3的全长重链及其片段，其中，所述可变 区结构域包括具有足以赋予抗原特异性的可变区序列的氨基酸序列。所述轻链可以是指包 括可变区结构域VL和恒定区结构域CL的全长轻链及其片段，其中，所述可变区结构域包括 具有足以赋予抗原特异性的可变区序列的氨基酸序列。此时，所述重链包括伽马(γ)、缪 (μ)、阿尔法(α)、德尔塔(δ)和伊普西龙(ε)的恒定区，而轻链包括卡帕(κ)和兰布达(λ)型的 恒定区。所述抗体可以例如为免疫球蛋白M(IgM)。 本发明另一方面提供一种产生与bPAG1特异性结合的抗体或其抗原结合片段的杂 交瘤细胞(保藏号为KCLRF-BP-00416)。所述与bPAG1特异性结合的抗体或其抗原结合片段 的具体内容如上所述。具体地，在本发明一实施例中，在获得小鼠脾细胞并与小鼠骨髓瘤细 胞融合培养后，仅选择鉴定出与牛妊娠血浆蛋白bPAG1特异性结合的抗体的杂交瘤细胞。然 后，将所述杂交瘤细胞保藏于韩国细胞系研究基金会(Korean  Cell  Line  Research  Foundation，KCLRF)，并于2017年12月22日获得保藏号KCLRF-BP-00416。 产生所述抗体的杂交瘤细胞可以用于将其在体外或体内大量培养。由所述杂交瘤 细胞产生的抗体可以不经纯化而使用，但为了获得最佳结果，可以根据已知的方法通过以 高纯度例如95％以上的纯度进行纯化来使用。可以使用纯化方法例如透析、盐沉淀和色谱 法等从培养基或腹水(ascites  fluid)分离所述抗体。 本发明另一方面提供一种用于诊断牛妊娠的组合物，其包括与bPAG1特异性结合 的抗体或其抗原结合片段。所述与bPAG1特异性结合的抗体或其抗原结合片段的具体内容 如上所述。所述组合物可以包括用于抗体的载体，例如稀释剂、缓冲剂、稳定剂等。所述组合 物可以包括用于检测抗原-抗体复合体的检测试剂。 本发明另一方面提供一种用于诊断牛妊娠的试剂盒，其包括所述抗体或抗原结合 4 CN 111587252 A 说　明　书 3/10 页 片段。所述与bPAG1特异性结合的抗体或其抗原结合片段的具体内容如上所述。具体地，根 据本发明的用于诊断牛妊娠的试剂盒可以包括特异性识别bPAG1的抗体或其抗原结合片段 以及用于免疫学分析的工具或试剂。所述抗体可以与具有序列号1的氨基酸序列的表位多 肽特异性结合。此时，用于免疫学分析的工具或试剂可以包括合适的载体、可以产生可检测 信号的标记物质、增溶剂和清洁剂等。当所述标记物质为酶时，所述试剂盒可以包括可以测 量酶活性的底物和反应终止试剂等。 所述载体为可溶性载体，例如本领域已知的生理学可接受的缓冲液，例如磷酸盐 缓冲盐水(PBS)、不溶性载体，例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丙烯腈、氟树脂、交联 葡聚糖、多糖、如乳胶中镀有金属的磁性细颗粒的高分子、其他纸张、玻璃、金属、琼脂糖及 其组合。 本发明另一方面提供一种诊断牛妊娠的方法，其包括：将与bPAG1特异性结合的抗 体或其抗原结合片段与受试体试料接触；以及检测与所述抗体或抗原结合片段结合的 bPAG1。所述与bPAG1特异性结合的抗体或其抗原结合片段的具体内容如上所述。 根据一实施例的诊断牛妊娠的方法包括将与bPAG1特异性结合的抗体或其抗原结 合片段与受试体接触的步骤。所述试料可以为从牛分离的生物试料。具体地，所述试料可以 为要确认妊娠与否的牛的乳汁、组织、细胞、血液、血清、血浆、唾液或尿液。所述接触的步骤 可以为在液体介质中孵育所述抗体或其抗原结合片段和试料。所述孵育可以在适合试料中 抗原和所述抗体之间的抗原-抗体结合的温度、pH和搅拌条件下进行。所述孵育可以在2℃ 至37℃下进行。所述孵育可以在pH6至pH8下进行。 根据一实施例的诊断牛妊娠的方法包括检测所述抗体或抗原结合复合体的步骤。 所述检测的步骤可以通过直接分离抗原-抗体复合体以确认其存在来进行，或者通过分离 或不分离而进行诸如生化学或免疫化学分析等的方法来进行。所述检测方法可以为选自酶 联免疫吸附 测定法 (E L I S A) 、免疫印迹法 (s t e r n  B l o t t i n g ) 、免疫荧光法 (Immunofluorescence)、免疫组织化学染色法(Immunohistochemistry  staining)、流式细 胞术(Flow  cytometry)、免疫细胞化学法、放射免疫分析法(RIA)、免疫沉淀分析法 (Immunoprecipitation  Assay)、免疫扩散分析法(Immunodiffusion  assay)、补体固定分 析法(Complement  Fixation  Assay)和蛋白芯片((Protein  Chip)中的任何一种。 在所述方法中，抗原-抗体复合体可以用可检测标记(detectable  label)或可以 产生可检测标记的物质标记。所述可检测标记或可以产生可检测标记的物质可以选自酶、 荧光物质、配体、发光物质、微粒(microparticle)、氧化还原分子和放射性同位素。所述酶 可以例如为β-葡萄糖醛酸苷酶、β-D-葡萄糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化物酶、碱性 磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶、己糖激酶和GDPase、RNase、葡萄糖氧化酶和荧光素 酶、磷酸果糖激酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、天冬氨酸转氨酶、磷酸烯醇式丙酮酸脱羧酶、 β-内酰胺酶或其组合。所述荧光物质包括但不限于荧光素、异硫氰酸酯、若丹明、藻红蛋白、 藻蓝蛋白、别藻蓝素、邻苯二甲醛、荧光胺等。配体包括生物素衍生物等。所述发光物质包括 吖啶酯、荧光素和萤光素酶等。所述微粒包括但不限于胶体金和经着色的乳胶等。氧化还原 分子可以为二茂铁、钌络合物、紫精、醌、Ti离子、Cs离子、二酰亚胺、1,4-苯醌、对苯二酚、 K4W(CN)8、[Os(bpy) ]2 3 、[RU(bpy)3]2 或[MO(CN) ]4-8 等。所述放射性同位素可以为3H、14C、 32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I或186Re等。 5 CN 111587252 A 说　明　书 4/10 页 如上所述，根据本发明的与bPAG1特异性结合的抗体或其抗原结合片段通过与根 据牛是否怀孕而出现或增加的血浆蛋白特异性结合来形成抗原-抗体复合体，并且通过对 所述抗原-抗体复合体的分析，可以使用相对简单的方法来诊断牛是否怀孕，所以可以通过 提高牛的繁殖效率而有效地应用于畜牧业。 有益效果 本发明一方面涉及一种与bPAG1特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中，由于 所述抗体与牛妊娠血浆蛋白bPAG1特异性结合，因此可以容易地诊断对繁殖很重要的牛等 动物的妊娠，从而可以通过提高繁殖效率而有效地应用于畜牧业。 附图说明 图1示出根据本发明的bPAG1的分子信息。 图2示出同种型筛选测试的结果。 图3示出在分离免疫球蛋白M后通过Bradford测定法确认的结果。在图3中，图3a示 出分离后的3B1克隆的定量图标，图3b示出分离后的3B3克隆的定量图标，图3c示出分离和 纯化后的抗体在膜上的活性程度的照片。 图4示出针对bPAG1的单克隆抗体的表位分析结果。 图5示出牛妊娠的诊断方法的示意图。 图6示出通过使用简单制备的试剂盒来诊断牛妊娠的结果的照片。