技术摘要：
本发明公开一种基于基因枪介导的棉花基因编辑方法及应用，属于基因工程技术领域。本发明方法通过下胚轴茎段培养获得胚性愈伤组织，利用基因枪将包埋好的基因编辑质粒DNA转化棉花胚性愈伤细胞，经过恢复培养、筛选培养和体细胞胚分化获得基因编辑幼苗。本发明所提供的基  全部
背景技术：
棉花是天然纤维的来源，是我国重要的经济作物。自上世纪八十年代基因工程技 术问世以来，经过三十余年的机理和技术研究的发展，基因工程在棉花育种中起到显著作 用。上世纪九十年代后期，棉铃虫虫害大面积暴发，导致全球棉花产量和种植面积大量减 少，甚至一度威胁棉花产业的生存。转基因Bt抗虫棉的培育和商业化应用，在棉花生产中发 挥了重要作用。Bt棉是指将苏云金杆菌(Bacillus  thuringiensis)的杀虫基因导入棉花获 得抗棉铃虫的转基因棉花，帮助棉农战胜棉铃虫灾害。尽管转基因棉花品种的商业化种植 已经开放了近30年。然而成功地运用到生产上的还是仅限于Cry1A，Cry1c和EPSPS等几个基 因。棉花的产量、纤维品质、抗病、抗逆等一直都是新品种选育的育种目标，相关的机理和机 制解析也有很好的研究基础。孟超敏等综述了棉花抗逆境相关基因的研究进展，提出利用 基因工程技术可成功地将棉花内源或外源的抗性相关基因转到棉花中，并获得相应表型显 著提高的转基因材料，但是这些工作目前还限于实验室研究，未真正应用于育种实践(孟超 敏等，2012)。最近几年，棉花不同参考基因组的测序完成释放出大量的基因信息，为深入机 理研究和深度挖掘基因组信息奠定了很好的基础和信息平台(Zhang  et  al.,2015；Hu  et  al.,2019)。 CRISPR-Cas系统广泛存在于细菌和古细菌中，是一种当病毒和质粒侵入时自适应 的免疫反应体系，利用向导RNA和靶DNA之间的碱基互补配对来实现识别功能，依赖多功能 的Cas蛋白介导切割作用(Carroll,2012)。基因编辑技术在植物研究中应用广泛，不仅可以 用来敲除基因，还可以用来定点插入、替换、染色体重组及多基因敲除(Dang  et  al ., 2015)。相比传统的转基因方法，基因组编辑技术的主要优势是通过对DNA结合蛋白或者向 导RNA的改造，实现对基因组上的位点进行靶向操作，能够更准确的实现目标基因整合或删 除，已经成功的运用在模式植物和多种作物中(Kim  et  al.,2016；Chen  et  al.,2019)。 棉花遗传转化方法主要有花粉管通道法、农杆菌介导的遗传转化和基因枪轰击转 化，这三种方法各有其优缺点。花粉管通道法是由我国分子植物育种学家周光宇先生提出， 优点是不受基因型限制，无需建立体外再生体系，可以在大田直接进行，操作简便、缩短育 种时间。该方法为我国棉花转基因育种做出了重要的贡献，利用该方法育出了转Bt基因抗 虫棉、抗病虫、抗除草剂和增产、优质的转基因棉花材料(周光宇等，1988；谢道昕等，1991； 李忠旺等，2012)。该方法的限制因素有：1)DNA整合机理不明确；2)只适用于拥有显著表型， 易于区分的亲本与“供体DNA”之间的整合；3)受外部环境影响较大，只能在开花时期进行， 注射部位定位模糊；4)转化成功率低(周光宇等，1988；段春燕等，2006)。农杆菌介导法是棉 花遗传转化最常用的方法。Umbeck等(1987)第一次报道了农杆菌介导的棉花下胚轴遗传转 4 CN 111575311 A 说　明　书 2/8 页 化及再生的技术体系。Firooza bady等报道了农杆菌转化棉花子叶的再生体系。 Subramaniam等(2001)对农杆菌菌株株系、受体基因型、乙酰丁香酮、共培养的温度、筛选阶 段起始时愈伤组织的大小和胚性愈伤组织的培养方式等棉花转化和再生过程的影响因子 进行了研究，并形成了一套较完整的体系。金双侠等(2017)通过筛选驯化受体Jin668，提高 了棉花转化效率和再生频率。棉花基因枪转化体系最早报道于1988年。McCabe等(1988)以 无菌的棉花种胚的胚轴切段为外植体，通过基因枪轰击后再继续培养为植株。Finer等 (1990)报道了基因枪轰击棉花悬浮的胚性细胞的转化及再生方法。Chlan等(1995)发表了 以50mg/L卡那霉素的剂量筛选获得阳性转化细胞的Coker312品系的基因枪转化体系。在35 个检测植株中31个NPT基因阳性植株，同时指出之前的农杆菌转化体系需要10-12个月才能 获得再生植株，而该方法可在轰击后三个月可得到移栽土里的再生植株(Chlan  et  al ., 1995)。 棉花基因枪体系的优化主要在于合适的转化外植体的选择，提高转化效率，缩短 转化周期，并能够保证遗传稳定性。Rech等(2008)以棉花种胚的胚轴作为轰击外植体，获得 了转基因棉花。首先将无菌种子浸泡在无菌水中，促进胚轴的伸长。等胚轴露出后，再进行 分离并以此作为基因枪轰击外植体。轰击后进行筛选培养，约2个月可获得转接到土壤的幼 苗(Rech  et  al.,2008)。Kanniah分别将分生组织作为外植体和悬浮胚性细胞系作为外植 体的基因枪轰击转化及再生体系进行了系统总结和优化。分生组织作为外植体转化和再生 体系最大的优点是大大缩短了转化再生周期，最快可以在轰击后一周内，将转化幼苗移栽 到土里。缺点是：1)分离合适的分生组织需要耗费人力和时间；2)嵌合体现象严重；3)分子 检测需要等到下一代进行(Rajasekaran,2013a)。悬浮胚性细胞系作为基因枪轰击外植体 的优点是：1)诱导出胚性细胞系可以长期保存，随时可以启动转化。2)转化率可达4％。其缺 点是：1)悬浮培养对细胞造成潜在生殖和发育的危害，畸形苗及不育现象时有发生；2)悬浮 培养的操作麻烦(Rajasekaran,2013b)。 本发明涉及的一种基于基因枪介导的棉花基因编辑方法，该方法是基于无激素诱 导的胚性愈伤组织分化技术，利用基因枪轰击，经过恢复培养、筛选培养和再生培养获得再 生苗。通过不同载体的转化证明，该方法具有转化效率高、再生周期短、转基因植株正常生 长发育等优势，对棉花基因功能研究和育种实践具有重要的作用。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种基于基因枪介导的棉花基因编辑方法及其应用。本发 明方法通过植物组织培养，获得棉花下胚轴茎段的胚性愈伤组织，利用基因枪轰击将包埋 好的基因编辑质粒DNA转化棉花胚性愈伤细胞，经过恢复培养、筛选培养和体细胞胚分化获 得基因编辑幼苗。 本发明的目的通过以下技术方案实现： 一种基于基因枪介导的棉花基因编辑方法，该方法包括以下步骤： 1)棉花胚性愈伤的获得：将在苗培养基上培养的无菌苗下胚轴茎段置于胚性愈伤 诱导培养基上进行胚性愈伤诱导培养，每22～35天继代一次，更换新的培养基，直至胚性愈 伤出现；挑取新诱导的胚性愈伤放在新的培养基中继代培养，待胚性愈伤转至米黄色的米 粒状愈伤，选取愈伤状态一致的胚性愈伤作为基因枪轰击外植体； 5 CN 111575311 A 说　明　书 3/8 页 2)基因枪轰击：将胚性愈伤继代在高渗培养基上培养后进行基因枪转化；所述的 基因枪转化的过程为：吸取25μL彻底涡旋好的浓度为60mg/mL的金粉悬浮液，吸取10μL无菌 超纯水，加入6μl浓度为500ng/uL的基因编辑质粒DNA，吸打混匀；加入50μL  2.5M的二水氯 化钙，再加入20μL  3mg/mL的鱼精蛋白(protamine)，快速混合涡旋后离心(优选为快速混合 涡旋3min，离心30s)去除上清；加入200μL无水乙醇，涡旋以悬浮金粉颗粒，离心，再去除上 清；重复该步骤一次；加入40μL无水乙醇，使金粉颗粒充分悬浮得到包埋好的金粉悬浮液； 每枪用10μL包埋好的金粉悬浮液进行基因枪轰击，一次轰击0.2g胚性愈伤； 3)恢复培养：基因枪转化后继续在高渗培养基上暗培养； 4)筛选培养：将恢复培养后的愈伤分为多个细胞群，小心继代在筛选培养基上，培 养至可明显见抗性愈伤的生长，将长势良好的愈伤继续继代培养； 5)诱导体细胞胚分化培养：在筛选培养基上培养后，将长势良好的愈伤挑选至诱 导体细胞分化的分化培养基上进行分化培养，每一个细胞群继代在一个培养瓶； 6)幼苗培育、炼苗及移栽：将步骤5)所获得的小苗，转在基本培养基上培养后用清 水洗净根部培养基，水培至有新的根长出来，将幼苗移栽培养完成整个生育期； 7)分子检测及基因编辑效率检测：待移栽植株长出新叶，取叶片提取总DNA，用于 PCR检测，利用U6启动子和U6终止子设计引物，验证sgRNA是否成功转化；利用Cas9特异引 物，验证Cas9蛋白的转化结果；又分别在编辑位点的5’端和3’端，设计上游引物和下游引 物，以叶片总DNA为模板，进行PCR扩增，将PCR产物纯化连接T载体，转化大肠杆菌感受态，挑 取单克隆菌液进行基因编辑的测序验证。 作为一种优选技术方案： 所述的基本培养基：大量元素母液(50mL·L-1) 铁盐母液(5mL·L-1) 微量元素母 液(5mL·L-1) 有机物母液(5mL·L-1) 葡萄糖(30g·L-1) 植物凝胶(3.0g·L-1) MgCl2 (1.0g·L-1)。 所述的苗培养基：大量元素母液(25mL·L-1) 植物凝胶(7g·L-1)，pH值调整为 5.8； 所述的愈伤诱导培养基：基本培养基 1.9g·L-1硝酸钾，pH值调整为5.8； 所述的高渗培养基：基本培养基 山梨醇(72.88g·L-1)，pH值调整为5.8； 所述的筛选培养基：基本培养基 1.9g·L-1硝酸钾 50mg·L-1卡那霉素，pH值调整 为5.8； 所述的分化培养基：基本培养基-NH4NO3(不包含NH4NO -13的基本培养基) 0.5g·L 天冬酰铵 1.0g·L-1谷氨酰铵，pH值为6.0。 进一步优选的，步骤(1)中无菌苗和胚性愈伤组织培养、步骤(5)中体细胞胚分化 培养和步骤(6)中再生苗培育的组培条件为：温度为28±2℃、光周期为白天/晚上16h/8h、 空气湿度为40％-60％、光照强度为12000～15000Lx。 进一步优选的，步骤(2)中打开真空泵和基因枪电源开关，基因枪的转化可采用 Bio-Rad公司的PDS  1000/He基因枪或其他公司类似设备，所述基因枪轰击的轰击条件：氦 气压力为1150psi，靶距为6cm的轰击位置。 进一步优选的，步骤(1)中所述的无菌苗为苗龄7d的无菌苗；所述茎段的长度为 1.0-1.5cm；每25～30天继代一次。 6 CN 111575311 A 说　明　书 4/8 页 进一步优选的，步骤(2)中将胚性愈伤放在高渗培养基上培养4h用于基因枪转化， 一次轰击0.2g胚性愈伤。 进一步优选的，步骤(3)中基因枪转化后继续在高渗培养基上暗培养16h，培养温 度28℃。 进一步优选的，步骤(4)中将恢复培养后的愈伤分为10-15个直径不大于3mm的细 胞群，小心继代在筛选培养基上，4周后可明显见抗性愈伤的生长，将长势良好的愈伤继续 继代再培养4周。 进一步优选的，将步骤5)所获得的小苗，转在基本培养基上，培养至4-5片真叶，用 清水洗净根部培养基，水培2-3周直至有新的根长出来，将幼苗移栽在含有蛭石和基质的纸 杯中，10～20天移栽到大盆，室外生长完成整个生育期。 上述的方法在棉花基因编辑中的应用。 本发明的优点表现在： (1)无需激素诱导即可获得胚性愈伤细胞。传统的棉花胚性愈伤诱导体系依赖2, 4-D和KT的作用，而2,4-D对植物细胞有一定的毒性，本发明中使用不含激素的培养条件培 养下胚轴茎段，2-3个月可出现胚性愈伤组织，体细胞胚明显大于激素诱导的体细胞胚，畸 形苗率低，幼苗更健壮，易成活，T0代结实率高。 (2)高效的转化方式可帮助提高基因编辑效率。本发明中提供的基因枪转化方法 会产生大量的瞬时转化产物，这些瞬时转化产物不会整合在植物基因组上，但仍可以起到 编辑作用，相比较少量的稳定转化体系提供了更高的编辑效率。另外，本发明中的愈伤细胞 的高渗培养技术，可以提高基因枪转化效率。 (3)缩短棉花遗传转化周期，节约时间和工作量。本发明所提供的基因枪轰击胚性 愈伤细胞经培养获得再生苗的方法，较以茎段为外植体的方法，省去了前期的胚性愈伤诱 导工作。茎段为外植体的方法中，每个茎段所诱导的愈伤组织被认定为一个独立转化事件， 因此，需要培养大量的茎段，才可获得研究所需的独立转化事件数。棉花属于难分化的植 物，诱导胚性愈伤组织的时间较长，再加上茎段为外植体的转化方式需筛选和愈伤诱导步 骤，获得胚性愈伤所需时间会更长，工作量很大。本发明中所提供的方法是前期在无需激素 诱导的条件下快速获得大量的胚性愈伤，以0.2g的胚性愈伤为一次轰击对象，获得10-15个 独立转化事件，大大节约了愈伤组织培养的工作量和时间成本。 附图说明 图1棉花基因枪遗传转化及再生流程。 图2pKSE401载体图。 图3sgRNAs在GhGL2和GhGL3基因上的位置。 图4基因编辑后代中sgRNA片段和Cas9基因的PCR检测结果。A图表示后代中 sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3片段的PCR检测结果，M表示5K的DNA  Marker，P表示sgRNA-pKSE401 质粒，WT为受体对照，3-11等分别为不同的sgRNA-pKSE401转基因T0代单株。 图5基因编辑T0代植株测序结果。GhGl2和GhGl3基因在棉花T0代植株的编辑情况。 黑色背景白色字体标注的是PAM位点，灰色背景白色字体标注是靶点序列，灰色背景黑色字 体标注是基因编辑结果，-2代表2个碱基的缺失。 7 CN 111575311 A 说　明　书 5/8 页 图6野生型和基因编辑T0代的表型。A为WT受体对照，B-H分别为sgRNA-pKSE401转 基因T0代不同单株的叶片表型。 图7T0代基因编辑植株中基因表达量和棉酚含量检测结果。A图为在基因编辑后代 中目的基因表达量检测结果。B图为在基因编辑后代中棉酚含量检测结果。