技术摘要：
本发明公开了一种提高染料脱色过氧化物酶活性的方法，属于酶工程领域。本发明中将编码染料脱色过氧化物酶(DyP)的基因与编码大肠杆菌内源谷氨酰‑tRNA还原酶的基因hemA共同连接到载体pET28a上，得到重组载体，将重组载体转入敲除了编码大肠杆菌内源通道蛋白基因eamA的大  全部
背景技术：
染料脱色过氧化物酶(DyP)是近年来新发现的一类过氧化物酶，在生物体内以血 红素为辅基，参与生物体的氧化应激调节和基质降解等过程。由于该酶能够降解蒽醌类染 料和木质素，可用于废水处理以及生物废弃物的再利用，因此成为研究热点。 在DyP的异源表达中常因辅基血红素的不足，导致酶活水平低下。大肠杆菌 (E.coli)作为重要的基因工程宿主菌，主要以谷氨酸为前体经C5途径合成血红素(图1)。谷 氨酸在谷氨酰-tRNA合成酶(gltX编码)和谷氨酰-tRNA还原酶(hemA编码)的催化下合成5- 氨基乙酰丙酸(ALA)，进而合成血红素。 以往的研究主要是通过外源添加血红素或者5-氨基乙酰丙酸(ALA)的方式来提高 辅基的供给，但这种方式会造成成本的增加和操作的不便。
技术实现要素：
针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种提高染料脱色过氧化物酶活性 的方法。本发明通过敲除通道蛋白eamA，阻碍ALA向细胞外的输送；结合过表达ALA合成关键 酶hemA，达到增加血红素胞内供给的目的(图1)，从而提升DyP的酶活性。该方法简便经济， 具有应用价值。 本发明提供了一种提高染料脱色过氧化物酶活性的方法，所述方法是将编码染料 脱色过氧化物酶的基因与编码大肠杆菌内源谷氨酰-tRNA还原酶的hemA基因共同连接到载 体上，得到重组载体，将重组载体转入宿主中得到大肠杆菌基因工程菌，表达大肠杆菌基因 工程菌，得到的重组染料脱色过氧化物酶活性提高；所述宿主是敲除了编码大肠杆菌内源 通道蛋白的eamA基因的大肠杆菌。 进一步地，所述宿主是敲除了编码大肠杆菌内源通道蛋白的eamA基因的大肠杆菌 BL21(DE3)。 进一步地，所述hemA基因的核苷酸序列为GenBank编号为AM946981.2所示核苷酸 序列的第1251856位-1253112位。 进一步地，所述eamA基因的核苷酸序列为GenBank编号为AM946981.2所示核苷酸 序列的第1569528位-1570427位。 进一步地，所述载体为pET28a。 进一步地，所述染料脱色过氧化物酶的GenBank编号为AAZ57111.1。 进一步地，所述表达是将大肠杆菌基因工程菌于30-37℃，200-220r/min活化培养 8-14h后，按1-4％接种体积比转接至LB液体培养基中培养，当菌体的OD600＝0.6-0.8时，加 入终浓度0.1-0.5mmol/LIPTG，30-37℃条件诱导8-14h。 本发明还提供了一种大肠杆菌基因工程菌，所述大肠杆菌基因工程菌以敲除了编 3 CN 111593061 A 说　明　书 2/3 页 码大肠杆菌内源通道蛋白的eamA基因的大肠杆菌为宿主，以编码染料脱色过氧化物酶的基 因与编码大肠杆菌内源谷氨酰-tRNA还原酶的hemA基因为目的基因。 进一步地，所述大肠杆菌基因工程菌以pET28a为载体；所述染料脱色过氧化物酶 的GenBank编号为AAZ57111.1。 进一步地，所述hemA基因的核苷酸序列为GenBank编号为AM946981.2所示核苷酸 序列的第1251856位-1253112位；所述eamA基因的核苷酸序列为GenBank编号为AM946981.2 所示核苷酸序列的第1569528位-1570427位。 本发明有益的技术效果在于： 本发明中将编码染料脱色过氧化物酶DyP的基因与编码大肠杆菌内源谷氨酰- tRNA还原酶的hemA基因共同连接到载体pET28a上，得到重组载体，将重组载体转入敲除了 编码大肠杆菌内源通道蛋白的eamA基因的大肠杆菌中表达，结果发现，表达后重组DyP的比 酶活显著提高。该方法简便经济，具有应用价值。 附图说明 图1：血红素合成示意图。 图2：敲除菌WT△eamA与出发菌株WT菌液在不同培养时间时的600nm吸光度值。 图3：WT和WT△eamA/pA的血红素含量。 图4：WT△eamA/pAD表达的重组DyP酶活。