技术摘要：
本发明公开了纳豆芽孢杆菌NT‑6在降解患病动物肉骨粉中抗生素的应用。本发明研究发现，纳豆芽孢杆菌NT‑6对抗生素具有显著降解作用，尤其是对磺胺嘧啶及磺胺二甲基嘧啶的降解率最高达95％。本发明首次研究发现纳豆芽孢杆菌NT‑6可有效降低患病动物肉骨粉中抗生素，大大  全部
背景技术：
目前，患病畜禽无害化处理已形成相当大的规模，运用最广泛的处理方法是将发 病和死亡的畜禽经高温杀菌和湿化机化制。而化制处理后的废渣经干燥处理后会得到大量 的肉骨粉，其中含蛋白质约40％～50％、矿物质约30％，是良好的饲用营养资源。但由于患 病动物在治疗过程中使用了大量的抗生素，造成肉骨粉中抗生素残留严重超标，尤其是磺 胺类抗生素残留严重，部分样品抗生素残留的浓度极高。因此限制了患病动物肉骨粉的进 一步利用，大多被直接丢弃或作为肥料使用，造成资源的极大浪费。目前病死畜禽无害化处 理工作开展的时间还很短，废渣的减害化和高值化加工利用的技术还很少。因此，寻找易于 推广、附加值高的患病畜禽肉骨粉的减害化和综合利用方法成为科学工作者们研究的热 点。 目前国内外对于患病动物肉骨粉中残留的抗生素降解技术的文献还是空白。而对 于抗生素降解的研究文献主要集中于抗生素污水处理，主要有γ-辐射降解法、超声波法、 钯金催化剂法、Fe 3载体氧化降解法和微生物降解法。γ-辐射降解法需要特殊的辐射设备， 对公共安全存在较大隐患，使用范围受到严格限制。超声波法效率较低。而钯金催化剂法和 Fe 3载体氧化降解法需要向基质中添加外源化学物，同时催化氧化过程会使蛋白质等营养 物质被氧化成有害物，会给肉骨粉造成二次污染。 微生物降解法是一种成本较低、温和的抗生素降解法，专利CN108611285A公开了 一种磺胺类抗生素降解菌，专利CN108611285A公开了一种磺胺类抗生素降解菌株酵母菌 (Sakaguchiacladiensis)A5，但是其对磺胺甲嘧啶和磺胺甲恶唑的降解为40％左右，且主 要针对废水废渣、水环境或土壤污染问题。而现有技术中高效降解磺胺类抗生素菌株较少， 特别是适合于患病动物肉骨粉中磺胺类抗生素降解的技术还没有报道。
技术实现要素：
本发明旨在解决上述技术问题，提供纳豆芽孢杆菌(Bacillus  natto)NT-6在抗生 素降解中的应用，本发明实验结果显示，纳豆芽孢杆菌NT-6能显著降解抗生素，降解率最高 可达95％。同时本发明发现纳豆芽孢杆菌NT-6能有效地降解患病动物肉骨粉中的抗生素， 利用纳豆芽孢杆菌NT-6发酵患病动物肉骨粉制备得到发酵产物如微生物肥料，可有效促进 农作物生长及防治立枯病，此外制备得到活性饲料添加剂中富含纳豆芽孢杆菌NT-6、抗菌 脂肽和营养小肽。本发明为安全、高值化地利用患病动物肉骨粉提供一种新途径、新思路， 不仅具有环境友好、资源节约、绿色安全等优点，同时具有很好的经济效益和社会效益，对 工农业发展也具有重要的意义。 本发明的目的是提供纳豆芽孢杆菌NT-6在降解抗生素中的应用。 3 CN 111587949 A 说　明　书 2/13 页 本发明另一目的是提供利用纳豆芽孢杆菌NT-6降解患病动物肉骨粉中抗生素的 应用。 本发明另一目的是利用发酵纳豆芽孢杆菌NT-6发酵患病动物肉骨粉制备发酵产 物并进一步制备成生物肥料或饲用活性饲料添加剂，扩大患病动物肉骨粉高值化利用。 本发明上述目的通过以下技术方案实现： 本发明通过研究发现，纳豆芽孢杆菌(Bacillus  natto)NT-6对抗生素具有良好的 降解效果，因此，纳豆芽孢杆菌NT-6在降解抗生素中的应用应在本发明的保护范围之内。 其中，本发明所述纳豆芽孢杆菌NT-6与专利CN201510616901.8所用的纳豆芽孢杆 菌NT-6是同一种同一株菌株，来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保 藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2013年9 月3日。 优选地，所述抗生素为磺胺类抗生素。 进一步，优选地，所述抗生素为磺胺嘧啶或磺胺二甲基嘧啶。 优选地，上述抗生素来源于患病动物肉骨粉。 纳豆芽孢杆菌(Bacillus  natto)NT-6可以显著降解患病动物肉骨粉中的抗生素， 并且利用无害化处理后的患病动物肉骨粉通过进一步发酵可制备富含纳豆芽孢杆菌NT-6、 抗菌脂肽和营养小肽的活性饲料添加剂。因此，本发明利用纳豆芽孢杆菌(Bacillus  natto)NT-6降解患病动物肉骨粉中抗生素并发酵制备饲用活性饲料添加剂的方法也应该 在本发明的保护范围之内。 优选地，一种降解患病动物肉骨粉中抗生素的方法，利用纳豆芽孢杆菌NT-6降解 患病动物肉骨粉中抗生素，所述患病动物肉骨粉中抗生素为磺胺类抗生素，更优选地，所述 抗生素为磺胺嘧啶。 优选地，本发明所述的患病动物肉骨粉为经过无害化处理的肉骨粉。 优选地，所述患病动物肉骨粉中磺胺嘧啶浓度不高于3.9mg/kg。按照上述步骤进 行抗生素降解时，所述患病动物肉骨粉中磺胺嘧啶浓度不高于3.9mg/kg时，配置的发酵液 对于纳豆芽孢杆菌NT-6无抑制作用，不影响菌株的正常生长。 此外，由于患病动物肉骨粉中往往含有大量抗生素，限制其被利用，导致大部分被 丢弃，不仅造成资源浪费，同时严重污染了环境。本发明通过大量研究发现，纳豆芽孢杆菌 NT-6，能有效降低患病动物肉骨粉中的抗生素，降解率高达66.40％。因此，本发明利用纳豆 芽孢杆菌NT-6作为发酵菌对患病动物肉骨粉进行发酵，制备发酵产物。 优选地，本发明所述的发酵产物由纳豆芽孢杆菌NT-6种子菌液接种到患病动物肉 骨粉发酵培养基中进行发酵，干燥、包装制得。 优选地，上述发酵产物制备方法包括以下步骤： 在患病动物肉骨粉中加入辅料混匀后加入水，调节pH至6.0-8.0，灭菌得发酵培养 基，按2％-6％的比例接种纳豆芽孢杆菌NT-6种子菌液，25-35℃条件下发酵培养80-120h， 得发酵物料，将发酵物料粉碎后干燥、包装即得。 作为一种可选择的优选方案，本发明提供一种将上述发酵产物作为微生物肥料在 促进农作物生长及防治立枯病中的应用。本发明所述微生物肥料含有的纳豆芽孢杆菌NT-6 菌量不低于1.0×109CFU/g，实验结果显示，本发明制备得到的微生物肥料不仅能显著促进 4 CN 111587949 A 说　明　书 3/13 页 农作物生长，并且能有效防治立枯病，降低病死苗的数量。 优选地，本发明提供一种上述微生物肥料的具体制备方法，包括以下步骤： S1.菌种活化：将斜面保藏的纳豆芽孢杆菌NT-6在35-37℃条件下培养18-24h； S2.种子菌液的制备：将步骤S1得到的活化的纳豆芽孢杆菌NT-6接种到灭菌培养 基中，在35-37℃、150r/min条件下培养18-24h，得到纳豆芽孢杆菌NT-6种子菌液； S3 .微生物肥料制备：将患病动物肉骨粉加入辅料混匀后加入水，调节pH至6.0- 8.0，灭菌得发酵培养基，按2％-6％的比例接种S2中所述种子菌液，25-35℃条件下发酵培 养80-120h，得发酵物料，将发酵物料粉碎后干燥、包装即得微生物肥料。 优选地，步骤S1菌种活化条件为37℃条件下培养24h。 优选地，步骤S2中在37℃、150r/min条件下培养24h，得到纳豆芽孢杆菌NT-6种子 菌液。 优选地，所述辅料为稻壳、花生壳、麸皮、玉米粉中的一种或多种。 优选地，步骤S3中患病动物肉骨粉与麸皮的质量配比为7.5-10：0-2.5，更优选地 为8：2。 优选地，步骤S3中稻壳添加量为0-1.6g，更优选的为0.8g。 优选地，步骤S3中步骤S3中初始基质水分含量为总发酵产物的33.3％-66.7％，更 优选的为60％。 优选地，步骤S4中种子菌液接种量为3％-5％，更优选为5％。 优选地，步骤S4中在25-37℃条件下发酵培养80-120h，更优选，发酵是时间为96h。 本发明提供上述方法获得的微生物肥料；所述微生物肥料中纳豆芽孢杆菌NT-6菌 量不低于1.0×109CFU/g。同时，本发明通过大量实验优化发酵过程中各项条件，以在发酵 产物中获得较高的纳豆芽孢杆菌NT-6菌量，实验表明初始基质含水量60％，肉骨粉与麸皮 质量的配比为8∶2(m/m)时，发酵96h此时的发酵条件最适合NT-6的生长能得到最多的NT-6 菌体数量，达到2.90×1010CFU/g。 另外，作为患病动物肉骨粉高值化的另一种应用，本发明还提供一种将所述发酵 产物作为活性饲料添加剂的应用。 优选地，活性饲料添加剂的制备具体包括以下步骤：将患病畜禽肉骨粉与水混合， 加入辅料，调节pH至6.7-7.5，制得发酵培养基，灭菌后，向所述发酵培养基中接入1-3％纳 豆芽孢杆菌NT-6菌种液，25-37℃，发酵培养40-72h，最后进行干燥、粉碎后即得。 进一步，优选地，所述辅料为面粉、麦草粉、糖蜜或葡萄糖中的一种或多种。 进一步，优选地，所诉辅料为面粉、麦草粉及糖蜜。更优选地，所述面粉为总重量的 0.8-1.5％，所述麦草粉为0.5-1.0％，所述糖蜜为0.3-0.8％。 进一步，优选地，所述水量为患病畜禽肉骨粉质量的0.8-1.5倍。 进一步，优选地，所述纳豆芽孢杆菌NT-6菌种液接种量为2％。 进一步，优选地，将接种后的发酵培养基放入旋转式固体发酵装置中发酵。 进一步，优选地，发酵温度为28℃，发酵时间为60h。 本发明提供上述方法获得的活性饲料添加剂；所述活性饲料添加剂含有纳豆芽孢 杆菌NT-6、抗菌脂肽和营养小肽，其中纳豆芽孢杆菌NT-6不低于1.0×109CFU/g(干重)，抗 菌脂肽含量为2-10g/kg(干重)，营养小肽占饲料总质量(干重)的15-25％。 5 CN 111587949 A 说　明　书 4/13 页 本发明具有以下有益效果：本发明研究发现纳豆芽孢杆菌NT-6能显著降解抗生 素，降解率最高可达95％。本发明抗生素降解方法与γ-辐射降解法比较，安全性更高；相对 于超声波法降解率显著提高；相对于钯金催化和Fe 3载体氧化法，不会给水体带来二次污 染。并且本发明具有成本低、抗生素降解速度快的特点。 此外，本发明首次发现纳豆芽孢杆菌NT-6可有效降低患病动物肉骨粉中抗生素， 降低了患病动物肉骨粉使用的安全隐患，同时利用纳豆芽孢杆菌NT-6对患病动物肉骨粉发 酵制备微生物肥料，并优化发酵条件使得肥料中含有较高的有效菌量。研究发现，本发明制 备得到的微生物肥料不仅能显著促进农作物生长，同时抑制部分有害的微生物，增强了抗 性能力而且减少立枯丝核菌导致的立枯病的发生几率。同时，本发明还利用患病动物肉骨 粉进行发酵发酵生产饲用活性饲料添加剂，该饲料添加剂富含益生菌、抗菌脂肽和营养小 肽，实现了一步即可达到减害化和高值化综合利用的患病动物肉骨粉目的。 本发明不仅实现了患病动物肉骨粉的高值化利用，且有效减少了环境污染，实现 了废弃下脚料的回收高效利用，同时开辟了植物病害生物防治新途径，不仅具有环境友好、 资源节约、绿色安全等优点，在安全优质农产品生产和生态环境保护中的也占有很高的地 位，具有很好的经济效益和社会效益，对工农业发展具有重要的意义。 附图说明 图1为纳豆芽孢杆菌NT-6对磺胺嘧啶的降解作用； 图2为纳豆芽孢杆菌NT-6对磺胺二甲基嘧啶的降解作用； 图3为患病动物肉骨粉发酵前后的抑菌圈大小； 图4为发酵前、发酵后以及对照中患病动物肉骨粉磺胺嘧啶浓度。 图5为初始基质含水量对NT-6菌量的影响； 图6为肉骨粉与麸皮的质量配比对NT-6菌量的影响； 图7为稻壳添加量对NT-6菌量的影响； 图8为发酵时间对NT-6菌量的影响； 图9为肉骨粉发酵过程蛋白质降解率变化； 图10为染立枯丝菌园土中不用微生物肥(右)及用微生物肥(左)的番茄苗根系； 图11为茎基腐病苗(左)与正常苗(右)的番茄苗根系。