技术摘要：
本发明公开了一种脱落乳牙的牙髓干细胞聚合体的制备方法，及由该制备方法制得的牙髓干细胞聚合体及其在制备用于恒牙再植的制剂中的用途。本发明的制备方法包括以下步骤：(1)将来自于脱落乳牙的牙髓组织洗净；(2)所述牙髓组织经胶原酶I和Dispase消化并获得细胞悬液；(3)  全部
背景技术：
牙齿再生的最终理想目标是用一颗再生的天然牙齿取代损失的牙齿。而乳牙干细 胞正是修复受损或病变牙组织，甚至牙齿脱落后进行整体修复的绝佳治疗方案。2003年，美 国施松涛教授课题组首次从脱落乳牙的冠和根的牙髓中分离出具有多分化能力的干细胞， 将其命名为脱落乳牙牙髓间充质干细胞(stem  cells  from  human  exfoliated  deciduous  teeth,SHED)。 脱落乳牙牙髓干细胞与牙髓干细胞(DPSC)、根尖牙乳头干细胞(SCAP)均为牙源性 干细胞且都来源于神经峭间充质细胞，但SHED是发育更早期的胚胎源性细胞，因此其增殖 水平、群体倍增数、克隆形成能力、多向分化能力均显著高于二者。研究显示SHED除了具有 成牙本质/牙髓分化，还可以分化为血管内皮细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经元细 胞、脂肪细胞、肝细胞等。另外SHED还具有较强的免疫调节功能，可以抑制Th17细胞活性，维 持机体的免疫平衡。基于上述SHED优越的生物学性能，一些研究者应用实验动物模型进行 SHED尝试性治疗皮肤伤口、颅骨缺损、脊髓损伤、免疫疾病、肝损伤等，均取得了良好的治疗 效果。脱落乳牙牙髓干细胞有广阔的应用前景，探索、优化和开发此干细胞的制备过程及新 的应用形式，不仅有利于保证脱落乳牙牙髓干细胞的生物学特性和效应，而且为开展大规 模临床试验治疗奠定了坚实的基础并提供了有力的保障。例如CN105087474A公开了一种乳 牙牙髓干细胞的培养方法，其乳牙来源是临床上儿童因滞留而拔除的乳切牙。 CN105087474A所公开的乳牙牙髓干细胞制备培养方法是牙髓组织胶原酶I消化后过筛，无 血清培养，且加入表皮生长因子、碱性成纤维生长因子。CN105602895A所公开的乳牙牙髓干 细胞制备培养方法是牙髓组织切块后，直接用间充质干细胞无血清培养(FasGrow)，添加因 子为重组人血小板源生长因子、重组人表皮生长因子的混合物。这两个专利所公开的培养 方法都是无血清培养、添加生长因子。血清含有丰富的营养成分，在促进干细胞增殖方面有 很好的效果，并且对干细胞的贴壁生长、集落形成有重大影响，但过高浓度不利于干细胞生 长。外源性生长因子对干细胞的生长有促进作用，但也有人认为多种生长因子对干细胞生 长并无协同作用。因此，添加生长因子的有益作用可能不足以补充无血清培养带来的影响， 脱落乳牙牙髓干细胞的制备方法和培养仍需不断优化和改进。 目前牙再生所采用的各种种子细胞多存在供源有限的问题，相对于从阻生牙和正 畸拔除牙中获取牙源性干细胞，脱落乳牙是一个更容易获得种子细胞的途径，目前国外己 经建立了多个SHED干细胞库。牙齿发育生物学研究显示牙齿的发育模式是由上皮和间充质 细胞的凝聚细胞团相互作用的结果，因此金岩教授课题提出了一种新的组织工程牙齿构建 方法——细胞聚合体组织工程(cell  aggregate  engineering)。其主要原理是将牙源性干 细胞经过诱导培养制成适宜形态的细胞团块进而移植至体内，最终原位发育成组织工程牙 4 CN 111548990 A 说　明　书 2/12 页 齿组织。细胞聚合体技术通过细胞自身分泌的细胞外基质形成内源性支架(endogenous  scaffold)，有利于细胞与细胞间、细胞与胞外基质间的交互作用和遗传信息的传递，有利 于维持细胞三维有序的发育空间，有利于细胞外基质的分泌和局部微环境的建立，进而有 利于组织工程牙齿组织的形态发生。脱落乳牙牙髓干细胞聚合体是由脱落乳牙牙髓干细胞 与其分泌的基质蛋白所形成的机能环境或者微环境，含有牙齿发育所需生物因子、具有牙 源性特征且形成了牙齿固有胶原网络结构，具有细胞悬液所没有的稳定的生物学特性、坚 韧的机械特性及独特的诱导微环境。 但是目前关于SHED细胞聚合体的生物学性能研究较少，缺乏一种有效地利用脱落 乳牙培养干细胞聚合体的方法。
技术实现要素：
为克服现有技术中缺乏有效地利用脱落乳牙培养干细胞聚合体并用于恒牙再植 的缺陷，本发明提供了一种脱落乳牙牙髓干细胞的制备方法及其应用。 现有技术制备干细胞聚合体的方法有1)使用细胞粘附因子或其他组分涂布培养 皿；2)搅拌悬浮培养、磁性纳米颗粒介导；3)采用无血清培养基培养基，并添加维生素C和地 塞米松等。现有技术脱落乳牙培养干细胞聚合体的培养过程并不利于后续临床移植，本发 明人发现，利用本发明的制备方法，使用仅含维生素C的培养液和含血清的培养基，可有效 地制备出可用于年轻恒牙移植的牙髓干细胞聚合体。发明人通过比较SHED细胞和恒牙DPSC 的细胞生物学行为，并检测脱落乳牙牙髓干细胞聚合体的相关生物学性能；并且开展临床 试验的初步探索性治疗，描述了一例接受SHED细胞聚合体用于冻干牙延迟再植完全脱位年 轻恒牙的治疗及预后评估，以期为后续临床试验的治疗和评估提供经验，为SHED的临床转 化应用有效性提供临床基础。 为解决上述技术问题，本发明的第一方面提供一种脱落乳牙的牙髓干细胞的制备 方法，所述制备方法包括以下步骤： (1)将来自于脱落乳牙的牙髓组织洗净，其中所述脱落乳牙自然脱落或松动后经 人工拔除，所述洗净为反复用PBS冲洗至表面无血液残留； (2)所述牙髓组织经胶原酶I和Dispase消化至无成形牙髓组织，终止消化后获得 细胞悬液，其中所述胶原酶I的浓度为100-300CDU/mL，所述Dispase的浓度为1-2.4U/mL。 (3)加入20-40mg/mL  VC培养液培养以获得牙髓干细胞聚合体。 优选地，在所述步骤(2)后、所述步骤(3)之前还包括以下步骤： (2 .1)将所述细胞悬液用含血清和抗生素的a-MEM培养基培养，以获得牙髓干细 胞；优选培养所述牙髓干细胞至80-85％汇合度； (2.2)PBS冲洗所述牙髓干细胞，优选冲洗2-3遍；和/或， (2.3)用胰蛋白酶消化所述牙髓干细胞以获得含单细胞的细胞悬液； 更优选地，还包括以下步骤： (2.4)检测所述牙髓干细胞的间充质干细胞标志物和/或胚胎干细胞标志物，和/ 或，在诱导成骨、成脂后检测成骨相关基因和/或成脂相关基因的表达；所述检测的结果为 阳性。 优选地，所述步骤(3)为： 5 CN 111548990 A 说　明　书 3/12 页 以1-10×105/孔接种所述牙髓干细胞，并加入20-40mg/mL  VC培养液培养后获得 牙髓干细胞聚合体，和/或，所述培养为培养12-14天；优选地，所示胶原酶I的浓度为 200CDU/mL，所述Dispase的浓度为2U/mL，所述VC培养液的浓度为30mg/mL，和/或，所述接种 以6-8×105/孔优选7×105/孔接种。接种可于本领域常规的细胞培养板中，例如于6孔板内。 优选地，在所述步骤(2)中，所述消化为在37℃孵箱内消化40min-1h，优选每隔5- l0min轻轻摇晃。 优选地，在所述步骤(2.1)中，所述血清为10％胎牛血清，所述抗生素为100U/mL青 霉素和/或链霉素，所述培养在37℃、CO2饱和度为5％的恒温箱培养。 优选地，在所述步骤(2.3)中，所述胰蛋白酶的浓度为2-3％优选2.5％，所述消化 的温度为37℃，和/或，所述消化的时间为30-60s优选40s。如无特殊说明，上述浓度指终浓 度。 优选地，在所述步骤(2.4)中，所述间充质干细胞标志物为Stro-1、CD34、CD45、 CD90、CD105和CD146中的一种或多种，所述胚胎干细胞标志物为Oct4和/或Nanog，所述成骨 相关基因为ALP、OCN、COL-1、RUNX-2，所述成脂相关基因为PPAR-r、LPL；优选地，所述间充质 干细胞标志物使用流式细胞仪检测，所述胚胎干细胞标志物、所述成骨相关基因和/或成脂 相关基因使用RT-PCR检测。 为解决上述技术问题，本发明的第二方面提供由第一方面所述的制备方法制得的 牙髓干细胞聚合体。 为解决上述技术问题，本发明的第三方面提供如第一方面所述的牙髓干细胞聚合 体在制备用于恒牙再植的制剂中的用途。 较佳地，所述恒牙为年轻恒牙，优选完全脱位的年轻恒牙；更佳地，所述乳牙牙髓 干细胞聚合体具有：抗炎症反应、抑制细胞凋亡、促进细胞增殖和血管生成的作用，和/或， 可促进恒牙的牙髓再生及牙周愈合。 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。 本发明所用试剂和原料均市售可得。 本发明的积极进步效果在于：本专利的制备方法获得的脱落乳牙的牙髓干细胞不 仅有间充质干细胞特性，同时表达胚胎性干细胞相关基因，其诱导分化能力强于牙髓干细 胞。此脱落乳牙牙髓干细胞聚合体可用于冻干牙延迟再植恒牙，优选完全脱位年轻恒牙；不 仅仅有抗炎症反应、抑制细胞凋亡、促进细胞增殖和血管生成的作用，更对完全脱位年轻恒 牙的牙髓再生及牙周愈合有理想的效果。 附图说明 图1显示了脱落乳牙牙髓干细胞的增殖能力； 图2显示了脱落乳牙牙髓干细胞的诱导分化能力； 图3为脱落乳牙牙髓干细胞的胚胎干细胞相关基因表达分析； 图4为诱导分化后脱落乳牙牙髓干细胞的成骨、成脂、软骨细胞染色鉴定； 图5为乳牙牙髓干细胞聚合体HE染色和PCNA免疫组化。 6 CN 111548990 A 说　明　书 4/12 页