技术摘要：
本发明公开了一种干扰非洲猪瘟病毒基因表达的siRNA，所述siRNA是下述双链RNA序列之一：1)正义链、反义链为SEQ ID NO:6‑7的双链RNA序列；2)正义链、反义链为SEQ ID NO:8‑9的双链RNA序列；3)正义链、反义链为SEQ ID NO:10‑11的双链RNA序列；4)正义链、反义链为SEQ ID N  全部
背景技术：
非洲猪瘟首次于1921年的肯尼亚被发现，是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种在 养殖猪中高度易感的烈性传染病，其致死率接近100％，目前尚没有任何疫苗和有效的抗病 毒药物来预防或治疗这种疾病。非洲猪瘟在撒哈拉以南非洲地区流行多年，60年代在西欧 大流行，在过去十多年中，它又在高加索，俄罗斯联邦和东欧的许多国家蔓延，特别是2018 年非洲猪瘟疫情首次在中国被发现，2019年9月中国生猪产量较上年同期下降了40％左右， 经济损失非常大，同时也对人民生活造成了很大影响。据世界动物卫生组织报道，在2018- 2019年由于非洲猪瘟造成全球性的经济损失估计在140亿元左右。目前切断非洲猪瘟传染 的途径只有隔离健康牲畜和扑杀感染牲畜的方法，并且病毒在自然环境中的存活能力很 强，在猪群中传染性非常快，所以有效的治疗非洲猪瘟的手段是目前应对疫情的迫切需要。 非洲猪瘟病毒是一种大型复杂的双链DNA病毒，是已知的唯一一种虫媒DNA病毒， 它的长度在170-193kbp左右，具有二十面体的多层结构。非洲猪瘟病毒编码超过160个蛋 白，其中还有很多蛋白的生物功能未能明确，一部分基因编码蛋白作为生物抑制剂来调节 宿主细胞的生物进程，进而影响到宿主免疫系统对病毒的免疫应答，这也是目前没有有效 疫苗和药物来控制/治疗非洲猪瘟的重要因素。 本发明使用RNA干扰技术(RNAi技术)开发新一代siRNA核酸药物。RNA干扰技术是 一种强大的手段，它可以用来抑制基因功能，比如通过破坏相应基因的mRNA，抑制基因的转 录或者抑制mRNA转译成相应蛋白来实现。RNA干扰技术能够在基因层面将靶标蛋白清除，极 大提高生物能源和资源的利用度，同时也极大减少了宿主体内正常生理活动所受的影响。 此技术通过将非洲猪瘟病毒在转录，复制和组装过程中涉及到的关键mRNA沉默并 降解，使其失去原有的功能，从而导致病毒的完整生物过程被打断，来抑制病毒的增长并最 终消除病毒。本发明干扰非洲猪瘟病毒基因表达的设计方案有下列两种：一是抑制病毒的 高度保守的关键基因，比如DNA聚合酶编码基因，RNA聚合酶编码基因等等，直接将病毒的复 制和转录过程破坏引起病毒凋亡；另一种是抑制病毒的一些特殊蛋白的编码基因，比如MGF  505-7R基因，MGF360-15R基因，EP402R等等，这些特殊蛋白可以抑制迟缓宿主体内的免疫应 答，或者引起高毒性和高传播性，从而使得病毒能够从宿主的免疫系统逃逸并导致高致死 率，通过抑制这些蛋白基因，可以延缓病毒增殖，恢复宿主的免疫应答，使得病毒能够被宿 主的自身免疫系统清除。非洲猪瘟病毒的基因序列已经明确，可以通过选择关键的基因序 列片段来设计抗病毒的专有siRNA药物。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种干扰非洲猪瘟病毒基因表达的siRNA及其应用，以解决 3 CN 111575289 A 说　明　书 2/5 页 现有技术的不足。 本发明采用以下技术方案： 本发明第一方面提供了一种干扰非洲猪瘟病毒基因表达的siRNA，所述siRNA对应 的靶序列为非洲猪瘟病毒MGF  505-7R基因、MGF  360-15R基因、EP402R基因、H359L基因或 O174L基因序列上连续的19-25个核苷酸。 进一步地，所述靶序列为序列表中的SEQ  ID  NO:1、SEQ  ID  NO:2、SEQ  ID  NO:3、 SEQ  ID  NO:4或SEQ  ID  NO:5所示序列。 进一步地，，所述siRNA是下述双链RNA序列之一： 1)正义链为序列表中的SEQ  ID  NO:6，反义链为序列表中的SEQ  ID  NO:7的双链 RNA序列； 2)正义链为序列表中的SEQ  ID  NO:8，反义链为序列表中的SEQ  ID  NO:9的双链 RNA序列； 3)正义链为序列表中的SEQ  ID  NO:10，反义链为序列表中的SEQ  ID  NO:11的双链 RNA序列； 4)正义链为序列表中的SEQ  ID  NO:12，反义链为序列表中的SEQ  ID  NO:13的双链 RNA序列； 5)正义链为序列表中的SEQ  ID  NO:14，反义链为序列表中的SEQ  ID  NO:15的双链 RNA序列。 进一步地，双链RNA  3′端还含有dTdT结构。 本发明靶序列为非洲猪瘟病毒MGF  505-7R，MGF  360-15R，EP402R，H359L，O174L基 因序列上连续的19-25个核苷酸，优选的含有19个核苷酸，GC含量控制在30％-52％之间，避 免出现超过4个连续的A或T。其中，MGF505-7R的靶序列对应MGF  505-7R基因的1258-1276序 列，MGF360-15R的靶序列对应MGF360-15R基因的541-559序列，EP402R的靶序列对应EP402R 基因的871-889序列，H359L的靶序列对应H359L基因的952-970序列，O174L的靶序列对应 O174L基因的284-302序列，其中对于非目的基因的连续匹配碱基数不超过15个碱基对。3’ 端dTdT结构增加了siRNA的稳定性。 本发明第二方面提供了上述干扰非洲猪瘟病毒基因表达的siRNA在制备抗非洲猪 瘟病毒药物中的应用 本发明的有益效果： 本发明公开了有效干扰非洲猪瘟病毒基因表达的靶序列和siRNA序列。针对非洲 猪瘟病毒的关键蛋白基因DNA聚合酶编码基因O174L，RNA聚合酶编码基因H359L，和重要调 节蛋白基因MGF  505-7R，MGF  360-15R，EP402R，根据基因干扰技术的靶点适用性，确定了上 述基因的靶序列，然后根据siRNA的设计规则，设计并筛选出相应的siRNA序列分子，可以高 效地沉默/抑制靶基因的生物表达。 本发明填补了非洲猪瘟的基因药物开发上的空白，并且siRNA药物开发具有时间 短，效率高，专一性强的特点。 本发明为预防和治疗非洲猪瘟病毒传染，快速研制抗病毒核酸药物提供了有效技 术和手段。 4 CN 111575289 A 说　明　书 3/5 页 附图说明 图1为pEGFP-N1质粒结构图。 图2为O174L基因、H359L基因、MGF  505-7R基因、MGF  360-15R基因、EP402R基因转 染NIH-3T3细胞后的PCR扩增图。 图3为O174L-siRNA、H359L-siRNA、MGF505-7R-siRNA、MGF360-15R—siRNA、 EP402R-siRNA对基因的抑制率。 图4为O174L-siRNA、H359L-siRNA、MGF505-7R-siRNA、MGF360-15R—siRNA、 EP402R-siRNA对蛋白的相对表达量。