技术摘要：
本发明提供纳米抗体靶向性泛素化降解细胞内源性Survivin的组合物，包括Survivin纳米抗体、Fc结构域、T2A多肽和TRIM21，所述组合物优选为Nb4A‑Fc‑T2A‑TRIM21。本发明采用纳米抗体和TRIM21共表达的方式，一方面可以提供纳米抗体以结合Survivin抗原，Fc片段以结合TRIM2  全部
背景技术：
生存素(Survivin)是凋亡抑制蛋白(IAP)家族中最小成员，也是作用最  强的IAP 家族分子，与IAP家族的其他凋亡抑制因子相比，Survivin在结构上  是十分独特的，仅仅含 有单个的BIR结构域和羧基末端的螺旋结构，并没有其  它可识别的蛋白质结构域。 Survivin蛋白由BIRC5基因编码，由4个外显子和  3个内含子组成，定位于17号染色体的端 粒区。Survivin在大多数人类癌细胞  中高度表达，但在正常的、终末分化的成人组织中几 乎不表达，并且Survivin  蛋白具有抑制肿瘤细胞凋亡、抑制细胞自噬、促进肿瘤细胞增殖 和促进肿瘤化  疗耐药等功能，从而使其成为肿瘤治疗的新靶点。研究表明，降低细胞内源 性  Survivin的表达量可以抑制细胞增殖和促进细胞凋亡，因此，对Survivin蛋白 的降解 的研究可以为开发新型抗肿瘤药物提供新思路。 如今有不少抑制Survivin表达的策略，可总结为以下四类：(1)Survivin  转录抑 制剂：多种Survivin反义寡核苷酸已被设计并成功地通过载体递送到细  胞，其能显著抑制 Survivin蛋白的表达，并最终促进细胞凋亡和抑制细胞增殖；  核酶是一类小的RNA分子，能 够通过核内切酶的活性裂解目标RNA，但是， 由于它们的局限性(例如，易于降解和异常的 细胞运输)，目前没有一个核酶  进入临床试验；此外还包括siRNA。(2)翻译后水平的 Survivin抑制剂：CDK  抑制剂和Hsp90抑制剂，许多CDK抑制剂例如黄吡醚和普瓦拉诺能够 抑制  Survivin在Thr34位点的有丝分裂磷酸化，从而加速Survivin的降解。(3)基  于 Survivin蛋白的疫苗：用含Survivin的载体转染的肿瘤细胞凋亡的激活；由  Survivin启动 子驱动的细胞毒素基因在肿瘤细胞中的表达。(4)基因治疗与  Survivin的突变体：基于T淋 巴细胞对特定肿瘤相关抗原的特异性识别，早期 的研究表明，一种基于Survivin的疫苗对 肝癌细胞有显著的细胞毒活性；  Survivin的负显性突变体也可以通过与细胞内源 Survivin形成异源二聚体，从  而抑制Survivin的功能活性。 基于以上几种方法，目前缺乏一种在蛋白质水平急剧降解Survivin的方法， 我们 想开发一种基于纳米抗体蛋白靶向的真正翻译后蛋白消耗方法，靶向细胞  内源性 Survivin蛋白急剧降解，这种方法区别于DNA靶向及RNA靶向，而是  直接消耗稳定的蛋白 质，并且研究Survivin降解后对细胞产生的影响。 抗体以高亲和力和特异性结合蛋白质，因此，抗体是靶向目标蛋白质的基  础。先 前已有研究使用抗体来干扰蛋白质功能，然而，这需要抗体结合到一个 阻止蛋白质功能的 表位上，并能有效地和内源性配体进行化学计量竞争，因此，  这种抑制方法只适用于数量 非常有限的蛋白质。由于抗体结合的蛋白可被细胞  溶质抗体受体TRIM21识别，TRIM21是E3 泛素连接酶，其以高亲和力结合  抗体的Fc结构域，TRIM21会将泛素-蛋白酶体系统募集到 3 CN 111569065 A 说　明　书 2/12 页 抗体结合的蛋白质 中，导致它们被降解。早在2007年就有文献提出IAP-XAFl复合物会在E3 连  接酶和蛋白酶体介导下，在蛋白水平降解细胞内源性Survivin蛋白；近期也有  研究表 明细胞质中的E3泛素连接酶CRL9能促进Survivin蛋白的泛素化降解 以维持细胞微管与基 因组稳定性，进而抑制肿瘤进程。 本实验室前期以人源Survivin为抗原，从随机七肽与十二肽噬菌体展示文  库中 筛选出一系列纳米抗体，其对Survivin的亲和力和特异性都比较强，共获  得10种嵌合纳米 抗体，经亲和力测定最终得到5种与Survivin有较高亲和力  的纳米抗体，分别为Nb1A， Nb2A，Nb4A，Nb1B和Nb4B，序列分别如SEQ ID  NO .5，SEQ  ID  NO .6，SEQ  ID  NO .1，SEQ  ID  NO.7和SEQ  ID  NO.8所示，  其中Nb4A为靶向Survivin最优的纳米抗体。[1.文章-Zhang  N, Guo  H ,Zheng W ,et  al .Design  and  screening  of  a  chimeric  survivin-specific  nanobody  and  its anticancer  activities  in  vitro[J].Anti  Cancer  Drugs,2016,27 (9):839-847.；2.专利-  靶向survivin纳米抗体及其制备方法和应用，马兴元，张娜，吴东， 郑文云，  郭华，胡发彪；3.学位论文-华东理工大学张娜：基于驼类抗体结构的Survivin  靶 向嵌合纳米抗体研制]。
技术实现要素：
本发明的第一个目的在于，提供纳米抗体靶向性泛素化降解细胞内源性  Survivin的组合物。 本发明第二个目的在于，提供含有纳米抗体靶向性泛素化降解细胞内源性 Survivin的组合物的重组质粒。 本发明第三个目的在于，提供纳米抗体靶向性泛素化降解细胞内源性  Survivin 的组合物的制备方法。 本发明第四个目的在于，提供纳米抗体靶向性泛素化降解细胞内源性  Survivin 的组合物或其重组质粒在制备治疗Survivin过表达的肿瘤的基因药物 中的应用。 为了实现上述第一个目的，本发明提供了纳米抗体靶向性泛素化降解细胞  内源 性Survivin的组合物，所述组合物包括Survivin纳米抗体、Fc结构域、T2A  多肽和TRIM21， 所述Survivin纳米抗体序列如SEQ  ID  NO.1、SEQ  ID  NO.5、  SEQ  ID  NO.6、SEQ  ID  NO.7或 SEQ  ID  NO.8任一所示。 作为一个优选方案，所述组合物为Nb4A-Fc-T2A-TRIM21，所述Nb4A的  序列如SEQ  ID  NO.1所示，所述T2A多肽前添加GSG三个氨基酸。 所述Fc为抗体的恒定区，可以是任意抗体的Fc片段，本发明所用的序列  来自抗 PD-L1抗体的Fc区，序列如SEQ  ID  NO.2所示。 为了实现上述第二个目的，本发明提供了含有纳米抗体靶向性泛素化降解  细胞 内源性Survivin的组合物的重组质粒。 作为一个优选方案，所述重组质粒为  pcDNA3.1( )-Nb4A-Fc-T2A-TRIM21。 为了实现上述第三个目的，本发明提供了所述纳米抗体靶向性泛素化降解  细胞 内源性Survivin的组合物的制备方法，利用Survivin的纳米抗体对Survivin 的靶向性，以 及抗体Fc区与泛素连接酶TRIM21羧基末端PRYSPRY结构域  特异性结合的能力，将纳米抗体 与抗体Fc区的基因序列融合，再用T2A小肽  连接实现与TRIM21的共表达。为了保证T2A的高 4 CN 111569065 A 说　明　书 3/12 页 切割效率以及下游片段的 正确定位表达，在T2A前添加了GSG三个氨基酸。 其中所述T2A小肽来自眀脉扁刺蛾β四体病毒衣壳蛋白，T2A序列如SEQ ID  NO.3所 示，所述的TRIM21序列如SEQ  ID  NO.4所示。 为了实现上述第四个目的，本发明提供了所述纳米抗体靶向性泛素化降解  细胞 内源性Survivin的组合物或其重组质粒在制备治疗Survivin过表达的肿瘤 的基因药物中 的应用。 作为一个优选方案，所述Survivin过表达的肿瘤包括肺癌、胰腺癌、肝癌、  乳腺癌 以及膀胱癌。因为Survivin在大多数肿瘤细胞中异常表达，并且发挥着  抗凋亡和促增殖的 功能，本发明中的组合物Nb4A-Fc-T2A-TRIM21是靶向所  有细胞中的Survivin以降解细胞 内源性Survivin为目的，没有细胞特异性，对  于Survivin过表达的肿瘤细胞均有降低其内 源Survivin蛋白表达量的效果，当  肿瘤细胞中的Survivin被降解后，会诱导细胞凋亡。 Western-Blot分析发现，Nb4A-Fc-T2A-TRIM21能大量降解细胞内源性  Survivin 蛋白，其降解Survivin的能力是Nb4A的3.72倍，TRIM21的2.84倍；  并且利用蛋白酶体抑制 剂MG132验证了该方法对Survivin的降解是由泛素-蛋 白酶体途径介导的。流式检测细胞 凋亡率发现，Nb4A-Fc-T2A-TIRM21对  MCF-7细胞的凋亡率达到58.52％，是单独的Nb4A和 TRIM21的两倍多，然  而对Survivin低表达的L-02细胞的凋亡率仅为14.56％，表明  Nb4A- Fc-T2A-TIRM21可以通过降解癌细胞中的Survivin进而促进细胞凋亡。 本发明选取利用噬菌体展示文库筛选出的针对Survivin的纳米抗体靶向  Survivin抗原，抗体以高亲和力和特异性结合蛋白质，尤其Nb4A更是具有分  子量小的优 势，更优的特异性，更强的识别抗原表位的能力。本发明实施例中 以Nb4A纳米抗体为例，利 用Nb4A与Fc区融合，运用T2A与TRIM21共表  达。T2A是由54个碱基编码的18个氨基酸的多 肽，来自于眀脉扁刺蛾β四体  病毒(Thoseaasigna  virus)衣壳蛋白，因为真核生物的核糖 体不能在甘氨酸(Gly)  和脯氨酸(Pro)两个氨基酸之间形成肽键，故能够形成两个单独的 多肽链。  为了保证T2A的高切割效率以及下游片段的正确定位表达，在T2A前加上  GSG三个 氨基酸，将其运用到本设计上实现了在同一真核细胞中Nb4A-Fc和  TRIM21的共表达，可以 达到由泛素连接酶TRIM21介导的细胞内源性Survivin 降解的目的。 本发明选取的TRIM21是E3泛素连接酶，其PRYSPRY结构域以高亲和  力结合抗体的 Fc结构域，Fc结构域是抗体的重链恒定区，其中重叠的-CH2-  和-CH3-结构域可与TRIM21结 合。TRIM21将泛素-蛋白酶体系统募集到纳米  抗体Nb4A结合的Survivin中，导致Survivin 被急剧降解，从而抑制了Survivin  在抗凋亡中的作用，促进肿瘤细胞凋亡的发生。 本发明的优点在于：我们采用纳米抗体和TRIM21共表达的方式，一方面  可以提供 纳米抗体以结合Survivin抗原，Fc片段以结合TRIM21；另一方面如  果细胞内源性TRIM21水 平不足以进行蛋白质的泛素化降解，则TRIM21可得 以补充，维持泛素化的正常进行。此方 式达到了靶向细胞内源性Survivin的泛  素化降解的目的，为下游研究Survivin降解后对 细胞产生的影响打下了坚实的  基础。本发明建立了一种直接在蛋白水平降解内源性 Survivin的平台，为临床 上靶向Survivin的肿瘤治疗提供新的策略。 附图说明 图1为纳米抗体靶向性泛素化降解细胞内源性Survivin的流程示意图。 5 CN 111569065 A 说　明　书 4/12 页 图2为抗体Fc片段氨基酸序列和3D结构的一致性分析，A图是运用  Muscle软件将 抗PD-L1抗体的Fc区氨基酸序列与人源IgG的Fc区氨基酸序  列做一致性分析，其中，1：人源 IgG的Fc区氨基酸序列，2：抗PD-L1抗体 的Fc区氨基酸序列；B图是运用I-TASSER对两个Fc 片段进行蛋白3D结构 预测的结果。 图3为Nb4A与Fc片段融合前后的蛋白3D结构，A图是Nb4A蛋白的  3D结构预测结果； B图是Fc片段的3D结构预测结果；C图是Nb4A-Fc融合 蛋白的3D结构预测结果。 图4为表达质粒构建体设计与示意图，A图为重组质粒pcDNA3.1( )-Nb4A  构建示 意图，B图为重组质粒pcDNA3 .1( )-Nb4A-Fc构建示意图，C图为重组  质粒pcDNA3 .1( )- TRIM21构建示意图，D图为重组质粒  pcDNA3.1( )-Nb4A-Fc-T2A-TRIM21构建示意图。 图5为纳米抗体Nb4A基因PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图，泳道M：DL  1000Marker；泳 道1：PCR扩增的Nb4A基因片段。 图6为Nb4A-Fc基因PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图，泳道M：DL  2000  Marker；泳道1： 重叠延伸PCR扩增的Nb4A-Fc基因片段。 图7为TR I M 21基因重叠延伸PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图，泳道M：  D L  2000Marker；泳道1：PCR扩增的TRIM21基因片段。 图8为Nb4A-Fc-T2A-TRIM21基因重叠延伸PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳 图，泳道M： DL  5000Marker；泳道1：重叠延伸PCR扩增的  Nb4A-Fc-T2A-TRIM21基因片段。 图9为质粒pcDNA3.1( )双酶切前后的琼脂糖凝胶电泳图，泳道M：DL  1000Marker； 泳道1：pcDNA3.1( )质粒；泳道2：pcDNA3.1( )质粒双酶切后。 图10为Western-blot分析细胞内源性Survivin的变化，分别将转染重组质  粒 pcDNA3.1( )-Nb4A、pcDNA3.1( )-Nb4A-Fc、pcDNA3.1( )-TRIM21、  pcDNA3.1( )-Nb4A-Fc- T2A-TRIM21和pcDNA3.1( )质粒转染于MCF-7细胞， 同时设置空白对照和Lipofectamine  3000阴性对照组，48h后，Western  Blot  检测细胞内Survivin的降解情况。A图为Western- blot结果图，B图是对各组  细胞内源性Survivin表达量的柱形统计图(**P<0 .01，***P< 0.001与对照  组比较，#P<0.05，mean±SD，n＝3)。其中，Control为空白对照；pcNDA3.1( )  代表转染质粒pcNDA3.1( )的阴性对照组；Nb4A代表转染重组质粒  pcNDA3.1( )-Nb4A的实 验组；Nb4A-Fc代表转染重组质粒  pcNDA3.1( )-Nb4A-Fc的实验组；TRIM21代表转染重组质 粒  pcNDA3.1( )-TRIM21的实验组；Nb4A-Fc-T2A-TRIM21代表转染重组质粒  pcNDA3.1( )- Nb4A-Fc-T2A-TRIM21的实验组；Lipofectamine3000代表只有转 染试剂不含DNA的对照组。 (在之后的内容中，出现上述的各组名称均代表与 此相同的含义)。 图11为Hoechst  33258核染观察细胞核形态的变化，A图为不同重组质粒  转染于 MCF-7细胞24h后的核染结果；B图为不同重组质粒转染于MCF-7细  胞48h后的核染结果；C图 为不同重组质粒转染于L-02细胞24h后的核染结  果；D图为不同重组质粒转染于L-02细胞 48h后的核染结果。(Bar＝100μm)。 图12为Annexin  V/PI双染法检测不同质粒对MCF-7细胞和L-02细胞的  促凋亡能 力，A图为流式检测不同质粒转染MCF-7细胞48h后对细胞的促凋  亡能力；B图为各组的MCF- 7细胞凋亡率的统计(***P<0.001与对照组相 比，mean±SD，n＝3)；C图为流式检测Nb4A- Fc-T2A-TRIM21对L-02细胞的  促凋亡能力。图13为蛋白酶体抑制剂MG132验证survivin通 过泛素-蛋白酶体  途径介导的降解。 6 CN 111569065 A 说　明　书 5/12 页 图13为Western  Blot分析MG132对重组质粒降解Survivin能力的干预，  0.5μM的 MG132预处理MCF-7细胞3h，分别将转染重组质粒  pcDNA3 .1( )-Nb4A、pcDNA3 .1( )- TRIM21、  pcDNA3.1( )-Nb4A-Fc-T2A-TRIM21转染于MCF-7细胞，设置空白对照组(同  样用 0.5μM的MG132处理，但不作转染)，48h后，Western  Blot检测细胞内  Survivin的表达水平。 图14为MG132对重组质粒促凋亡能力的影响，A图为在有无MG132的  干预下，流式 细胞仪检测不同质粒转染MCF-7细胞48h后的细胞凋亡率(上  层为加0.5μM  MG132的流式细 胞仪检测结果，下层为无MG132的流式细胞  仪检测结果)；B图为各组的MCF-7细胞在有无 MG132的干预下细胞凋亡率 的对比(***P<0.00，与 MG132组相比，mean±SD，n＝3)。