技术摘要：
本发明公开了一种热稳定性提高的角蛋白酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明采用全质粒PCR对携带角蛋白酶基因的质粒进行定点饱和突变，构建筛选得到热稳定性突变重组菌，得到角蛋白酶突变体T78C和T78E。热稳定性研究结果显示角蛋白酶突变体T78C和T78E在60℃  全部
背景技术：
角蛋白酶是一种能够降解角蛋白类底物(例如羽毛，羊毛，牛羊角等)的特异性角 蛋白酶，由真菌、放线菌和细菌等多种微生物产生。角蛋白酶作为一种底物专一性较宽泛， 水解催化能力强的蛋白酶，广泛地运用于畜牧行业、饲料行业、制革行业、医药行业中，具有 巨大的研究与应用价值。 但是，野生角蛋白酶的酶活及热稳定性普遍较差。在工业化应用上对酶的要求苛 刻，如高温环境会很大程度影响角蛋白酶的酶活。在实际应用中通常需要加热来加速反应， 提高了能耗，且角蛋白酶粉制备时的喷雾干燥过程也需要加热。因此，热稳定的角蛋白酶在 实际应用中非常重要。目前，提高酶热稳定性的方法主要包括固定化、化学修饰、补充添加 剂、酶的转译后修饰和蛋白质工程等方法。虽然前两种策略可以提高酶的热稳定性，但是需 要附加工艺对酶进行处理，增加了生产成本。因此，应用蛋白质工程的手段从分子水平提高 酶的热稳定性将是一个新的研究手段。 随着绿色产业的推动，迫切需要角蛋白酶产业化的实现，但目前角蛋白酶的热稳 定性总体仍未达到商业化应用的需求。课题组前期已经构建获得一株具有高角蛋白水解酶 活的角蛋白酶重组菌，其在15L发酵罐上角蛋白酶活力达到426.60KU/mL以上(该角蛋白酶 记载于Biotransformation  of  keratin  waste  to  amino  acids  and  active  peptides  based  on  cell-free  catalysis文献中)，是目前文献已报道的重组角蛋白酶表达的最高 水平。但是该角蛋白酶的热稳定性不高，所以为了进一步提高酶的应用性能，有必要进一步 提高上述角蛋白酶的热稳定性。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明提供了角蛋白酶突变体，采用定点饱和突变策略，对 亲本酶的氨基酸位点进行突变改造，以提高角蛋白酶的热稳定性。 本发明提供了角蛋白酶突变体，所述角蛋白酶突变体是以氨基酸序列如SEQ  ID  NO.2所示的角蛋白酶为亲本，对亲本角蛋白酶的第78位进行突变。 在本发明的一种实施方式中，将亲本角蛋白酶的第78位苏氨酸突变为半胱氨酸得 到突变体T78C，所述突变体T78C氨基酸序列如SEQ  ID  NO.3所示。 在本发明的一种实施方式中，将亲本角蛋白酶的第78位苏氨酸突变为谷氨酸得到 突变体T78E，所述突变体T78E氨基酸序列如SEQ  ID  NO.4所示。 本发明还提供了一种编码所述的角蛋白酶突变体的基因。 本发明还提供了一种携带编码所述突变体酶的述基因的重组质粒。 在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pP43NMK质粒。 3 CN 111575265 A 说　明　书 2/6 页 本发明还提供了携带编码所述突变体酶的基因或所述重组质粒的宿主细胞。 在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌或真菌。 在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌(Bacillus  subtilis)WB600。 在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞的构建方法为将携带编码所述突变体 酶的基因的重组表达载体通过电击法或化学转化法转入宿主细胞。 本发明提供一种降解角蛋白酶的方法，所述方法为以鸡羽毛为底物，加入突变体 T78C和/或T78E，进行反应。 在本发明的一种实施方式中，所述方法为以含角蛋白的物质为底物，加入纯化后 的突变体T78C和/或T78E，在37℃反应4h。 在本发明的一种实施方式中，所述含角蛋白的物质包括皮毛、弹性蛋白、鳞片、纤 维。 在本发明的一种实施方式中，所述含角蛋白的物质包括皮肤、酪蛋白、毛料、指甲、 羽毛。 本发明提供了一种所述突变体、基因、表达载体或宿主细胞在畜牧业、饲料业、制 革业、医药业中的应用。 本发明还要求保护所述突变体、基因、表达载体或宿主细胞在降解皮肤、毛发、酪 蛋白、弹性蛋白、毛料、指甲、鳞片、纤维、毛发角蛋白中的应用。 本发明的有益效果：本发明采用全质粒PCR构建得到角蛋白酶突变体T78C、T78E， 热稳定性研究结果显示角蛋白酶突变体T78C和T78E在60℃的半衰期均为亲本酶的2.25倍 和2.1倍，更具有应用价值与潜力。 附图说明 图1为角蛋白酶突变体T78C，T78E的枯草芽孢杆菌上清SDS-PAGE凝胶电泳；其中，M 代表蛋白分子量标准，不同泳道代表不同的突变蛋白，箭头指示目的蛋白条带位置。 图2为不同突变体与对照菌在60℃热稳定性比较。 图3为突变体降解羽毛图；a为0h的反应体系；b为4h后的反应体系。