技术摘要：
本发明提供了一种逆转录环介导基因恒温扩增技术(RT‑LAMP)检测冢村氏菌活菌的引物组合、试剂盒及检测方法，能够安全、快速、准确检测冢村氏菌活菌，特异性强、灵敏度高，操作简便，且可通过肉眼观察扩增结果，成本低廉，易于在基层推广使用。
背景技术：
冢村氏菌属(Tsukamurella)在细菌分类学上属放线菌目，是生长缓慢且具  有弱 或不定抗酸性的专性需氧革兰氏阳性不规则杆菌，迄今为止已发现13种，  其中7种与人类 疾病相关。冢村氏菌属主要侵袭免疫力低下人群，该属微生物感  染与慢性肺部疾病、免疫 抑制(白血病，肿瘤，HIV/AIDS感染)以及术后伤口 感染有关。 冢村氏菌属与含分枝菌酸的其他物种如放线菌目中的红球菌属、诺卡菌属、 戈登 菌属和分枝杆菌属等有许多共同的表型特征，因此在标准的生化试验中可 能被误判。冢村 氏菌属感染患者多见慢性呼吸系统症状，与肺结核相同，其临  床表现容易与结核分枝杆菌 感染引起的肺结核病混淆，不易鉴别。临床上经常  将冢村氏菌感染误诊为结核杆菌感染， 这不仅会影响患者的诊断与治疗，也会  导致疫情资料的错误。因此，在临床诊断中，快速鉴 定冢村氏菌属感染对于病 人的治疗、医院的传染病防治都至关重要。 目前国际上对于冢村氏菌的诊断主要基于生化检测、限制性酶切片段分析  及 16rRNA测序。其中，传统的生化检测对于冢村氏菌的检测需要排除在生化性  状上极其相似 的其它属，并且要经过数目众多的一组反应才能确诊，而且在某  些情况下结果并不准确， 容易误判。由于该菌生长缓慢(约1周)，且生化反应  所用时间长，种类多，使得对该致病菌 的检测效率低下，完全确诊需要2-3周时  间，应用受到限制。而以分子生物学PCR为基础的 限制性酶切片段分析及新近发  展起来的测序技术均需要复杂的仪器设备和技术要求，价 格高昂，不利于推广  普及。 环介导基因恒温扩增技术(loop-mediated  isothermal  amplification  of  nucleic acid，LAMP)是一种新型恒温基因扩增技术，可直接通过肉眼观察结果，具有快  速、简便、敏感性和特异性高、检测范围广等优点，而且扩增只需单一的恒定  温度，不需要 专门的扩增和检测仪器即可实现现场高通量快速检测，具有比常  规PCR技术更广泛的应用 前景。但PCR、LAMP等分子生物学检测法是针对冢村 氏菌DNA基因为靶序列设计引物并进行 扩增，死菌或活菌都呈现阳性效果，无 法用于临床评估抗菌治疗效果。
技术实现要素：
本发明提供了一种逆转录环介导基因恒温扩增技术(reverse transcription- LAMP，RT-LAMP)检测冢村氏菌活菌的引物组合、试剂盒及检测  方法，能够安全、快速、准确 检测冢村氏菌活菌，特异性强、灵敏度高，操作  简便，且可通过肉眼观察扩增结果，成本低 廉，易于在基层推广使用。 根据本发明的一个方面，本发明提供一种引物组合，包括： 正向外引物F3：5’-AGGTGTGGGTTTCCTTCCA-3’ 4 CN 111549149 A 说　明　书 2/6 页 反向外引物B3：5’-ATGTCCACCACGTACCGA-3’ 正向内引物FIP： 5’-AGTTTCCTTAACTGCCCCCGG-AACGCATTAAGTACCCCGC-3’ 反向内引物BIP： 5’-TCGATGCAACGCGAAGAACCTT-CTACACCAAACGGAACACG-3’ 正向环引物LF：5’-CCCAGGCGGGGTACTTAATG-3’ 反向环引物LB：5’-TACCTGGGTTTGACATATAGAGGA-3’。 根据本发明，上述引物是冢村氏菌活菌的RT-LAMP检测用引物。 根据本发明的第二个方面，本发明提供一种试剂盒，其中，含有本发明的  引物组 合。优选地，上述外引物和内引物的总摩尔比为1∶2-1∶12，进一步优选为  1∶8，上述外引物 和环引物的总摩尔比为1∶3-1∶6，进一步优选为1∶4；优选地，上  述正向外引物和反向外引 物的摩尔比、上述正向内引物和反向内引物的摩尔比、  上述正向环引物和反向环引物的摩 尔比均是1∶1。 优选地，试剂盒中进一步含有甜菜碱、MgSO4、dNTPs、BstDNA聚合酶、  重组核糖核 酸酶抑制剂和M-MLV反转录酶。 优选地，试剂盒中进一步含有钙黄绿素和MnCl2。 优选地，试剂盒中包括扩增反应液，所述反应液含有如下组分：本发明的  正向外 引物、反向外引物、正向内引物、反向内引物、正向环引物、反向环引  物、甜菜碱、MgSO4、 dNTPs、BstDNA聚合酶、重组核糖核酸酶抑制剂、M-MLV  反转录酶；优选地，所述反应液中进 一步含有钙黄绿素和MnCl2；进一步优选，  所述反应液中进一步含有buffer、KCl、(NH4) 2SO4、Tween20，其中buffer优选为  Tris-HCl  buffer。 优选地，试剂盒中进一步包括阳性对照，所述阳性对照为冢村氏菌RNA，  进一步优 选为微变冢村氏菌标准株RNA；进一步优选，试剂盒中进一步包括阴  性对照，所述阴性对照 为水，进一步优选DEPC水。 优选地，试剂盒包括扩增反应液，所述反应液含有如下组分：5pM的正向外  引物 F3、5pM的反向外引物B3各1μL；40pM的正向内引物FIP、40pM的反向内  引物BIP各1μL；20pM 的正向环引物LF、20pM的反向环引物LB各1μL；含pH为  8.8的40mM  Tris-HCl  2×buffer、 20mM  KCl、20mM(NH4)2SO4、0.2％Tween20、  1.6mM甜菜碱、16mM  MgSO4、2.8mM  dNTPs的混合 液12.5μL；8U  BstDNA聚  合酶1μL；20U重组核糖核酸酶抑制剂1μL；100U  M-MLV反转录酶1μ L；5mM/μL  钙黄绿素和10mM/μL  MnCl2的混合液1μL。检测时，在扩增反应液中加入1μl提  取 自待测样品的RNA或者阳性对照或者阴性对照，然后加DEPC水至25μL进行扩  增反应。 根据本发明，上述试剂盒是冢村氏菌活菌的RT-LAMP检测用试剂盒。 根据本发明的第三个方面，本发明提供一种冢村氏菌活菌的RT-LAMP检测  方法： 包括如下步骤： (1)提取待测样品中的RNA； (2)使用上述引物或者上述试剂盒扩增步骤(1)得到的RNA；优选地，  反应温度为 60-65℃，更优选约63℃；优选地，反应时间为15-50min，更优选约  30min； (3)终止反应，判断待测样品中是否含有冢村氏菌活菌；优选地，至少约  80℃灭活 至少约5min终止反应。 5 CN 111549149 A 说　明　书 3/6 页 优选地，使用上述试剂盒中的扩增反应液扩增步骤(1)得到的RNA：将1μl  步骤(1) 得到的RNA加入到上述扩增反应液中，并加DEPC水至25μL进行扩增。 优选地，设置阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为冢村氏菌RNA，进一  步优选为 微变冢村氏菌标准株RNA，所述阴性对照为水，进一步优选DEPC水。  本领域技术人员可以理 解，将阳性对照和阴性对照与步骤(1)得到的RNA同时  进行上述步骤(2)和(3)。 根据反应管的颜色判断待测样品中是否含有冢村氏菌活菌，当待测样品中  含有 冢村氏菌活菌时，反应管肉眼可见变绿色，否则保持淡橙色。 本发明提供的用于冢村氏菌活菌检测的RT-LAMP的引物组合设计合理，特  异性 强；含有该引物组合的试剂盒特异性强、灵敏度高，操作方便，可通过肉 眼观察扩增结果。 冢村氏菌16SrRNA半衰期短，仅存在于代谢增殖的活菌中。与DNA的单一  拷贝相 比，16SrRNA拷贝数更多。本发明选择能合并反转录功能的RT-LAMP方  法，不仅有助于判定 活菌，而且可以进一步提高灵敏性；检测方法简单，灵敏  度高，检测过程便捷，扩增反应快， 节省时间，30min内即可完成扩增，扩增结 果靠肉眼可观察，能特异性检测活菌。 附图说明 图1为RT-LAMP引物的相对位置和特异识别位点图 图2为实施例4特异性检测结果图：图中1-6分别为土地戈登菌RNA、牛型结  核菌 RNA、戈登分枝杆菌RNA、星形诺卡氏菌RNA、球状红球菌RNA及结核分  枝杆菌RNA为待测物的 RT-LAMP检测结果，7-11分别为仁川冢村氏菌RNA、微  变冢村氏菌RNA、耐酪氨酸冢村氏菌 RNA、肺冢村氏菌RNA及肺炎冢村菌RNA  为待测物的RT-LAMP检测结果，12为微变冢村氏菌标 准株RNA阳性对照，13为  DEPC水阴性对照。图中7-12为绿色，其余为淡橙色。 图3是实施例5灵敏性检测结果图：A为RT-LAMP凝胶电泳及钙黄绿素染色 图，B为 LAMP凝胶电泳及钙黄绿素染色图。图中1-8分别对应5.0×105cfu/ml～  5.0×10-2cfu/ml时 的扩增情况，图中9为DEPC水对照。A中1-7为绿色，8和9为淡  橙色；B中1-5为绿色，6-9为淡 橙色。 图4是实施例6检测极限实验中RT-LAMP凝胶电泳及钙黄绿素染色图。图中  1-10分 别对应0.1ng～0.1ag时的扩增情况，图中11为DEPC水对照。1-9为绿色，  10和11为淡橙色。