技术摘要：
本发明涉及一种用于评估乙型肝炎患者免疫细胞功能的标志物及其应用，属于细胞技术领域。所述标志物包括：CD4 的T细胞、CD8 的T细胞、Tfh细胞和Th细胞。上述标志物可以较精准的反映HBV感染患者的免疫功能状态，最后分析若判断免疫功能低下，则提示可能需要免疫干预，如  全部
背景技术：
肝细胞癌(hepatocellular  carcinoma，HCC)是最常见的肝脏恶性肿瘤，占比高达 约90％，从而严重威胁着人类的健康。乙型肝炎病毒(hepatitis  B  virus，HBV)感染和非酒 精脂肪性肝病(nonalcoholic  fatty  liver  disease，NAFLD)均是HCC发生的高危因素。在 我国，引起HCC的一个主要因素即为HBV。 目前，国内外研究证明HBV感染与病毒、肝脏微环境以及宿主抗病毒的免疫应答密 切相关。其中免疫机制包括天然免疫、获得性免疫，在这个过程中极为重要。获得性免疫系 统可分为细胞免疫和体液免疫，分别由T淋巴细胞和B淋巴细胞介导，T淋巴细胞则主要分为 CD4 T细胞和CD8 T细胞，CD4 T细胞可在抗原刺激下产生细胞因子，发挥重要的免疫调节作 用。效应性CD8 T细胞可通过杀伤病毒感染的肝细胞，或释放细胞因子的非杀伤性机制清除 病毒。 综上所述，HBV感染进程与患者机体免疫系统功能息息相关。但基于免疫系统的复 杂性以及HBV疾病谱多样性，目前关于HBV感染的免疫学研究尚不明确，而在临床方面，HBV 感染患者主要检查项为乙肝五项，其次则检测较为常见的化验指标，如血常规、电解质、肝 功、肾功、凝血功能等，以及通过重要的指标病毒定量检测，来确定外周血液中是否存在明 显的病毒复制。而究竟如何做到在HBV感染的整个疾病进程中更为系统且精准的评估HBV感 染患者的免疫功能，也正是亟待解决的关键问题。 目前文献报道的能检测免疫功能的方法有：1、通过免疫细胞受体(TCR)的多样性 分析免疫功能，这种方法属于间接的方法，方法复杂，需要专门仪器设备，对分析人员要求 极高，数据分析难度大，成本高，不利于推广应用；2、通过分析血液的血清中细胞因子水平， 间接分析免疫功能，这种方法成本极高，需要专门仪器设备，操作难度高，对人员的技术水 平要求高，不利于临床推广应用。 迄今为止，市场上还没有能对HBV感染患者免疫细胞功能进行全面分析、检测的技 术或产品，临床上缺乏一个详细的能量化的、快速的且耗费较低的免疫功能检测评估方案， 即，目前还没有针对HBV感染患者的免疫细胞功能评价方法，更没有可供参考的参数。
技术实现要素：
基于此，有必要针对上述问题，提供一种免疫细胞功能分析系统及应用，采用该分 析系统对肝病患者进行分析，能够为临床对HBV感染患者后期治疗方案的调整提供可靠依 据。 一种用于评估乙型肝炎患者免疫细胞功能的标志物，所述标志物包括：CD4 的T细 胞、CD8 的T细胞、Tfh细胞和Th细胞。 3 CN 111579779 A 说　明　书 2/7 页 由于HBV感染与T细胞功能失调等密切相关，故发明主要针对T细胞进行功能检测。 本发明对比分析了健康人样本(健康对照组)和肝病样本(患者组，可细分为HBV HCC-组， HCC HBV-组，HBV HCC 组)的外周免疫功能，主要是对外周血中CD4 T细胞、CD8 T细胞、B细 胞、NK细胞等免疫细胞的各项功能指标进行了分析，发现了9项免疫功能指标与该疾病具有 高度相关性。比如，CD4 T细胞在HBV感染患者中显著上升，而CD8 T细胞则明显下降，这些指 标与HBV感染患者疾病进程中免疫功能的发展变化均具有高度相关性。 而前期研究显示，乙肝病毒的清除是依赖于T细胞活性的，T细胞反应低下的原因 之一，是由于通过抑制Notch信号的激活而大量产生的调节性T细胞(Tregs)抑制了CD4/CD8  T细胞。这其中指向的指标变化结果与上述分析结果相吻合，据此，可以上述标志物作为HBV 感染患者的免疫功能指标。 基于指标组合的设计性及精准性，本发明人又在上述9项免疫功能指标中进行了 筛选，最终选定以上4项标志物作为检测指标，可用于HBV感染患者的辅助治疗及预后监测。 在其中一个实施例中，所述CD4 的T细胞为CD3 和CD4 的免疫细胞，所述CD8 的T 细胞为CD3 和CD8 的免疫细胞，所述Tfh细胞为CD3 、CD4 和CD185 的免疫细胞，所述Th细 胞为CD3 、CD4 和CD185-的免疫细胞。 在其中一个实施例中，所述标志物在乙型肝炎患者免疫细胞功能的评估中，所述 CD4 的T细胞在T细胞中的占比参考值为40～67％，所述CD8 的T细胞在T细胞中的占比参考 值为31～58％，所述Tfh细胞在CD4 的T细胞中的占比参考值为23～41.2％，所述Th细胞在 CD4 的T细胞中的占比参考值为…… 本发明还公开了上述的标志物在诊断、治疗和/或预后评估乙型肝炎中的应用。 本发明还公开了检测生物样本中上述的标志物的试剂在制备乙型肝炎患者免疫 细胞功能评估试剂中的应用。 本发明还公开了一种评估乙型肝炎患者免疫细胞功能的试剂盒，包括有检测生物 样本中上述的标志物的试剂。 在其中一个实施例中，包括抗人CD3抗体，抗人CD4抗体，抗人CD8抗体和抗人CD185 抗体。 在其中一个实施例中，所述试剂盒用于流式细胞仪检测，所述抗人CD3抗体，抗人 CD4抗体，抗人CD8抗体和抗人CD185抗体均为带荧光的抗人单克隆流式抗体，所述抗人单克 隆流式抗体标记的荧光染料包括：FITC，VioGreen，PE/Cy7，PerCP/Cy5.5。 在其中一个实施例中，所述生物样本为人外周血。 本发明还公开了一种科研用途的乙型肝炎患者免疫细胞功能评估方法，包括以下 步骤： 取外周血，提取分离得到外周血单核细胞，与抗人CD3抗体，抗人CD4抗体，抗人CD8 抗体和抗人CD185抗体进行孵育，随后以流式细胞仪进行检测，得到上述的标志物的含量， 对免疫细胞功能进行评估。 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： 本发明的一种用于评估乙型肝炎患者免疫细胞功能的标志物，可以较精准的反映 HBV感染患者的免疫功能状态，若分析判断免疫功能低下，则提示可能需要免疫干预，如通 过药物、功能食品或生物治疗的方法提高机体的免疫功能，从而达到提高HBV感染患者治疗 4 CN 111579779 A 说　明　书 3/7 页 有效率的目的。 本发明的用于评估乙型肝炎患者免疫细胞功能的标志物适用于所有HBV感染患 者，从而在免疫细胞功能状态的角度上，精准评估HBV感染患者现阶段免疫功能状态是否适 合某种临床治疗方案以及在选择更适宜治疗方案上提供一定的可靠依据。 且将上述标志物用于评估乙型肝炎患者免疫细胞功能中，具有专属性好，特异性 强，准确度高的优势，对免疫细胞亚群的测定精准度可达90％以上。 因此，采用本发明提供的标志物以及方法，能够简便，准确，高效地评价HBV感染患 者免疫细胞功能的状态。对于提高HBV感染患者治疗有效率(即辅助治疗)，以及后期治疗方 案的制定都具有重要的临床意义。 本发明的评估乙型肝炎患者免疫细胞功能的试剂盒，通过流式细胞仪检测4种免 疫功能指标(biomarker)，虽然也需要专门的仪器设备，但优势极其显著，如测得的数据直 接反映了外周免疫细胞的功能，并且具有操作简单，对人员要求相对较低，检测成本低的优 势，利于推广应用。 附图说明 图1为不同组别Lymphocytes中B  cells分析对比示意图； 图2为不同组别None  B  Lymphocytes中CD3   T  cells分析对比示意图； 图3为不同组别CD3 T  cells中CD4   T  cells分析对比示意图； 图4为不同组别CD3 T  cells中CD8   T  cells分析对比示意图； 图5为不同组别CD3 T  cells中DNT  cells分析对比示意图； 图6为不同组别None  B  Lymphocytes中NK  cells分析对比示意图； 图7为不同组别Lymphocytes中γδT  cells分析对比示意图； 图8为不同组别CD4 T  cells中Tfh分析对比示意图； 图9为不同组别Tfh  cells中CD183 CD196-cells分析对比示意图； 图10为不同组别Tfh  cells中CD183-CD196-cells分析对比示意图； 图11为不同组别CD4 T  cells中Th分析对比示意图； 图12为不同组别Th  cells中CD183 CD196-cells分析对比示意图； 图13为不同组别Th  cells中CD183-CD196-cells分析对比示意图； 图14为不同组别CD4 T  cells中CD185 cells分析对比示意图； 图15为不同组别CD4 T  cells中CD185-cells分析对比示意图； 图16为不同组别CD4-CD185-中CD183-cells分析对比示意图； 图17为不同组别CD3 T  cells中Memory  T  cells分析对比示意图； 图18为不同组别CD3 T  cells中Naive  T  cells分析对比示意图； 图19为不同组别CD3 T  cells中Activated  T  cells分析对比示意图； 图20为Tfh细胞在HBV病毒高拷贝组和低拷贝组中的分析对比示意图； 图21为Th细胞在HBV病毒高拷贝组和低拷贝组中的分析对比示意图； 图22为CD4   T细胞在HBV病毒高拷贝组和低拷贝组中的分析对比示意图； 图23为CD8   T细胞在HBV病毒高拷贝组和低拷贝组中的分析对比示意图； 图24为流式细胞检测示意图。 5 CN 111579779 A 说　明　书 4/7 页