技术摘要：
本发明涉及一种SARS‑CoV‑2灭活疫苗及其制备方法，所述制备方法包括如下步骤：步骤(1)Vero细胞的复苏和规模化培养；步骤(2)接种工作种子批毒种、病毒培养及一次性收获病毒液，即为病毒收获液；步骤(3)第一次病毒灭活、浓缩及第二次病毒灭活后得灭活病毒浓缩液；步骤(4  全部
背景技术：
2019年12月末发生严重急性呼吸道综合症疫情，病原学检测结果证实为一种新型 冠状病毒，随后细胞分离获得新型冠状病毒株。国际病毒分类委员会将该新型冠状病毒命 名为重症急性呼吸综合征冠状病毒2(severe  acute  respiratory  syndrome  coronavirus  2，SARS-CoV-2)，WHO将该病毒导致的疾病命名为新型冠状病毒肺炎(coronavirus  disease  2019，COVID-19)。COVID-19疫情已造成全球范围的大流行，COVID-19给各国人民生命财产 安全和社会发展带来了巨大的危害。 流行病学研究表明，COVID-19冠状病毒感染后，常见呼吸道症状为发热、干咳、乏 力,肌痛、气促和呼吸困难、淋巴细胞减少症，重症和危重病例可导致肺炎、严重急性呼吸综 合征、肾衰竭，甚至死亡。 病毒主要传播途径为呼吸道飞沫传播、密切接触传播，特殊环境下的气溶胶传播， 也可能存在粪口传播途径和母婴传播。医学干预治疗手段为支持治疗和对症治疗，目前尚 无针对性抗冠状病毒感染特效药和疫苗上市。 加强预防性COVID-19疫苗研发，对疫情的应急防控和远期控制具有重要意义。预 防新冠病毒可能的广泛传播而造成的持续或重新流行，迫切需要快速研发疫苗及目标人群 接种,特别是高风险的医护人员，其他参与病原诊断、治疗、药物临床研究、防疫一线的工作 人员，及重症、病死率高的高危人群，也需要疫苗接种保护高危人群。 许多研究机构开展了疫苗的研发工作，这些疫苗包括基于反向遗传学操作的减毒 活疫苗、亚单位疫苗(主要表面抗原S蛋白)、DNA疫苗(S基因)、病毒载体疫苗(腺病毒，痘病 毒等载体)以及灭活苗。灭活疫苗是通过物理或者化学处理等方法使病毒失去感染性而制 备成的疫苗。灭活疫苗不具有致病性，但基本保持了病毒的免疫原结构，因此是安全有效的 经典疫苗手段。 目前利用细胞工厂大规模培养Vero细胞用于病毒性疫苗已有多款上市产品，包 括：口服脊灰减毒活疫苗、肠道病毒71型灭活疫苗和冻干甲型肝炎减毒活疫苗等。目前，还 没有用于预防新型冠状病毒感染的疫苗上市，利用细胞工厂培养Vero细胞，再接种特定的 新型冠状病毒毒株进行病毒培养和收获制备新型冠状病疫苗，还未见报道。
技术实现要素：
本发明首先涉及一种SARS-CoV-2病毒的灭活疫苗的制备方法，所述方法包括如下 步骤： 步骤(1)Vero细胞的复苏和规模化培养； 步骤(2)接种工作种子批毒种、病毒培养及一次性收获病毒液，即为病毒收获液； 4 CN 111569058 A 说　明　书 2/7 页 步骤(3)第一次病毒灭活、浓缩及第二次病毒灭活后得灭活病毒浓缩液； 步骤(4)灭活病毒浓缩液纯化后得疫苗原液； 具体的： 步骤(1)所述Vero细胞复苏和规模化培养为： 取工作细胞库的1支或多支同批Vero细胞，经复苏扩增、胰蛋白酶替代物消化、37 ℃±1℃培养制备的一定数量并用于接种病毒的细胞为一个细胞批。 使用的细胞培养液为含5％～10％新生牛血清的199培养液，置于细胞工厂内，37 ℃培养至均匀单层Vero细胞；随后培养3～6天，至细胞密度2～5×107个/ml，优选的，培养6 天，至细胞密度约为5×107个/ml； 步骤(2)所述的接种工作种子批毒种、病毒培养及收获为： 1)替换Vero细胞培养液为病毒维持液，所述病毒维持液为199培养液和DMEM培养 液的混合液，优选的，所述病毒维持液为199培养液和DMEM培养液按照体积比2：1混合的混 合液，每100 L病毒维持液加入0 .1～1 0m l工作毒种，工作毒种病毒滴度不低于 6 .00LgCCID50/ml；优选的，每1ml工作毒种加入100L病毒维持液中，工作毒种滴度为 8.00LgCCID50/ml；； 2)将病毒维持液加入细胞工厂中，培养条件为37℃±1℃；培养3～6天，观察细胞 病变，细胞病变CPE达到80％以上时，一次性收获病毒液，即为病毒收获液； 步骤(3)所述的病毒的第一次病毒灭活、浓缩及第二次病毒灭活具体为： 1)病毒收获液立即加入甲醛灭活：甲醛溶液直接加入盛装病毒收获液的容器中， 使终浓度37％甲醛溶液与病毒收获液的积比1:1000～10000，置37℃下灭活3～8天； 或者2)于2～8℃放置后用β-丙内酯灭活：病毒收获液温度达到2～8℃后，β-丙内 酯与病毒收获液体积比1:2000～8000，置于2～8℃下灭活2～4天； 第一次病毒灭活完毕后，采用100～300KD膜包超滤浓缩20～80倍得病毒浓缩液； 随后对病毒浓缩液进行第二次病毒灭活操作得灭活病毒浓缩液，灭活步骤同第一 次灭活，如二次采用β-丙内酯灭活时，灭活完成后将灭活病毒液置37℃水解至少2小时，以 确保β-丙内酯完全水解； 步骤(4)所述的灭活病毒浓缩液纯化步骤为： 将灭活病毒浓缩液采用柱色谱法进行凝胶过滤层析纯化，色谱介质为琼脂糖凝胶 Sepharose  4FF或Sepharose  6FF(优选为Sepharose  4FF)，采用PH7.4、浓度为0.01mol/L的 PBS溶液洗脱，每次上样量不超过层析柱体积的10％，280nm紫外监测收集第一峰，即为目的 蛋白峰，即获得SARS-CoV-2病毒疫苗原液，原液置于2～8℃保存； 所述的最终接种病毒的细胞工厂为10和/或40层细胞工厂。 进一步的，所述的SARS-CoV-2病毒疫苗原液经检定合格后，在配制容器中按铝终 浓度为0.80～1.20mg/ml加入氢氧化铝佐剂，在混匀的状态下加入原液，补加pH  7.2～7.4 磷酸盐缓冲液至新型冠状病毒特异性抗原含量为200～800WU/ml(WU代表新型冠状病毒灭 活抗原单位)所需体积，混匀，即为半成品。分装在预灌封注射器或者西林瓶中，0.5ml/支。 本发明还涉及由所述方法制备获得的SARS-CoV-2病毒灭活疫苗。 本发明的有益效果在于： 1、采取两步病毒灭活，规模化制备新型冠状病毒灭活疫苗过程中，由于病毒收获 5 CN 111569058 A 说　明　书 3/7 页 液体积较大，封闭化管道操作过程中，可能存在部分病毒收获液粘附于管壁或瓶壁，从而导 致存在灭活死角，基于此，选择超滤浓缩后的病毒浓缩液进行第二次病毒灭活，进一步降低 生物安全风险；两次灭活确保疫苗的生物安全。 2、本发明选择100～300kD超滤膜包对灭活的病毒收获液进行灭活病毒抗原浓缩 富集处理，同时去除部分小分子杂蛋白；超滤浓缩后，采取了Sepharose  4FF或Sepharose  6FF为凝胶过滤层析介质，去除与病毒颗粒分子量相差较大的大部分牛血清、宿主细胞DNA 以及宿主细胞蛋白，大大减少了疫苗原液中杂质含量，在保证疫苗效力的同时最大限度提 高了疫苗的纯度，降低了疫苗内杂质的含量，从而降低了人体由于接种而引起不良反应的 几率。 3、本发明制备的新型冠状病毒灭活疫苗在体外相对效力测定、体内效力、异常毒 性、热稳定性试验、内毒素含量、牛血清白蛋白残留量、Vero细胞DNA残留量、Vero细胞蛋白 质残留量等方面均达到工艺设计要求，这得益于优化的工艺，要点是细胞经细胞工厂培养， 换无血清病毒维持液接种病毒，操作简单，并且大幅度的降低了成本，有利于细胞病变的控 制并能够大幅度提高病毒收获液的病毒滴度，从而有效提高疫苗的效力；收获的病毒液经 两次病毒灭活，确保最终原液不含有活的病毒；病毒液经超滤、凝胶过滤，最大限度降低了 疫苗原液中杂质含量、保证了单位蛋白中有效抗原含量高，从而保证了疫苗的效力。 附图说明 图1、接种工作毒株3天后的Vero细胞照片，图中明显可见细胞染毒病变。 图2、疫苗制备工艺流程图。 图3、4FF填料凝胶过滤层析图谱。 图4、6FF填料凝胶过滤层析图谱。 图5、疫苗供试品的抗体效价GMT值。