技术摘要：
本发明提供了一种检测胆管癌患者外周血循环肿瘤细胞FGFR基因突变的试剂盒及检测方法，属于分子生物学技术领域。该试剂盒包括稀释液、脱色液、染色液A、染色液B、FGFR（人）一抗、山羊抗人IgG/HRP、0.1%Triton X‑100、0.3%H2O2、试剂A、试剂B、6×PBS缓冲液。）本发明提  全部
背景技术：
肝内胆管癌发病率约占原发性肝脏恶性肿瘤的15-20%，且呈上升趋势。大部分肝 内胆管癌病人初次就诊时常伴有局部侵犯或远处转移而失去手术根治机会。以吉西他滨联 合铂类的化疗方案被推荐为治疗晚期胆管癌的一线方案，客观反应率（ORR）为15-26%，且常 发生耐药。目前，临床上缺乏其他有效的治疗药物和方案。 最新研究表明，根据Pemigatinib二线治疗晚期胆管癌（FIGHT202）研究更新数据 显示，晚期胆管癌基因检测FGFR2融合/重排组ORR为35.5%，其中3例患者完全缓解（CR），CR 率为2.8%，DCR为82%，而FGFR突变及非突变组ORR为0%，可见将来基于基因检测FGFR2融合/ 重排的胆管癌患者应用Pemigatinib靶向治疗可能具有较好的疗效，但对于无法获得组织 胆管癌患者无法进行基因检测FGFR2融合/重排状态，而且胆管肿瘤穿刺活检面临出血、胆 瘘、感染等风险，亦不能实时动态检测FGFR2融合/重排、突变，因此对晚期胆管癌患者外周 血中基于循环肿瘤细胞FGFR2检测对胆管癌靶向治疗具有重要临床指导意义，使部分患者 避免不必要的手术创伤及穿刺风险。 因此，检测胆管癌循环肿瘤细胞(CTC)FGFR2表达对胆管癌靶向治疗疗效评估具有 重要价值。
技术实现要素：
为了克服晚期或复发胆管癌患者无法实时或反复穿刺获取组织标本、进而不能评 估患者FGFR实时动态状态的不足，本发明提供了一种胆管癌患者外周血FGFR的实时检测方 法：利用膜过滤装置分离获得晚期胆管癌患者外周血中的循环肿瘤细胞（CTC），进一步运用 免疫组化技术检测CTC上FGFR表达情况。 本发明采用的技术方案如下： 本发明提供了一种检测胆管癌患者外周血循环肿瘤细胞FGFR基因突变的试剂盒，包括 稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A  0 .5mL、染色液B  1mL、FGFR（人）一抗100μL、山羊抗人  IgG/HRP  100μL、0.1%  Triton  X-100  100μL、0.3%  H2O2  100μL、试剂A、试剂B、6×PBS缓冲液  60mL；所述PBS缓冲液的pH值为7.4。 进一步的，所述稀释液是由1mmol/L  EDTA 0.1%  BSA 0.1%海藻糖 0.2%聚氧乙烯 聚氧丙烯醚嵌段共聚物组成，所述基础液为Tris-HCl缓冲剂。 进一步的，所述脱色液是由95%酒精与100%二甲苯按容积比1:1组成。 4 CN 111596058 A 说　明　书 2/6 页 进一步的，所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。 进一步的，所述试剂A为0.6%的羟丙基甲基纤维素水溶液；所述试剂B为乙醇和1， 2-丙二醇按照体积比3：1组成。 本发明还提供了一种利用上述试剂盒非诊断目的检测胆管癌患者外周血循环肿 瘤细胞FGFR基因突变的方法，包括以下步骤： （1）利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的中晚期胆管癌患者外周血中的CTC： 采集无法获取组织标本的中晚期胆管癌患者外周血：肘正中静脉外周血5ml； （2）外周血样预处理：将采集的外周血样采用稀释液进行10倍稀释，稀释后加多聚甲醛 固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%； （3）利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血CTC：将预处理的外 周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤； （4）过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器，将循环肿瘤细胞染色液A液 0.5ml加入到滤器中，染色3min，PBS缓冲液冲洗干净；滤液过滤完全后加入染色液B液1ml， 染色2min，纯水1ml冲洗2次，取下滤膜，放置在载玻片上，干燥后在显微镜下观察，确定是否 存在CTC； （5）运用免疫组化技术检测CTC的FGFR表达情况。 本发明检测CTC的FGFR表达的具体方法如下： （1）脱色：将带有CTC的滤膜从载玻片上取下，置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色 液； （2）滴加100μl  0.1%  Triton  X-100，室温孵育15min，DI水洗2min×3次； （3）滴加100μl  0.3%  H2O2，室温孵育10min，PBS洗2min×3次；（4）滴加100μl  FGFR（人） 一抗，室温孵育2h或4℃过夜，PBS洗2min×3次； （5）滴加100μl山羊抗人  IgG/HRP，18～26℃温度下孵育20min，PBS洗2min×3次； （6）滴加100μl  DAB显色液，18～26℃孵育并随时在显微镜下观察显色情况，观察时间 为3～10min； （7）显色完成后，弃掉DAB显色液，流水冲洗5min，苏木素染色5min； （8）盐酸酒精分化8秒，自来水返蓝5min； （9）将返蓝后的CTC采用75%乙醇（1min），95%乙醇（1min），100%乙醇（1min）梯度乙醇脱 水，然后加入0.5mL试剂A，振荡均匀后，加入1mL试剂B，摇动混合均匀后，离心沉淀，将沉淀 物采用中性树脂封固； （10）光学显微镜下镜检。 本发明所使用的膜过滤分离肿瘤细胞装置，包括滤器、血样容器、废液缸和铁架 台，所述铁架台设有底座、立架和支架，所述血样容器通过支架设置于铁架台上部，血样容 器的下方为滤器，滤器通过输液器联通至废液缸，废液缸设置于底座上。 所述滤器包括滤器上口、滤膜、载滤膜平台和滤器下口，滤膜置于载滤膜平台上； 滤器上口接血样容器，滤器下口通过输液器接废液缸。 所述滤膜为疏水材料制成，其上均匀布满口径为8微米的滤孔。 本发明的有益效果是： （1）本发明提供的检测方法，不用穿刺活检获取组织标本即可检测到中晚期胆管癌患 5 CN 111596058 A 说　明　书 3/6 页 者FGFR表达情况。该技术属于微创，并能够实时检测。 （2）本发明提供的方法，能够避免染色过程中可能产生的边缘效应导致的假阳性 结果，稳定性好，降低细胞的损失，提高检测的准确性。 附图说明 图1为本发明的膜过滤装置结构示意图； 图2为本发明膜过滤装置的滤器的结构示意剖视图； 图3为本发明膜过滤装置的滤器滤膜的结构示意图； 图4为胆管癌患者外周血分离获取的循环肿瘤细胞影像图。 图中：1铁架台、2血样容器、3滤器、4输液器、5废液缸、6滤器上口、7滤膜、8载滤膜 平台、9滤器下口、10滤孔、11底座、12立架、13支架。