技术摘要：
本发明涉及一种禽流感病毒H7N9亚型N蛋白IgY抗体胶体金检测试纸及方法，属于H7N9 IgY抗体快速检测技术领域，所述试纸包括PVC底板，及依次搭接在PVC底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述结合垫为包被有兔抗鸡IgG‑胶体金复合物的胶体金垫，所述硝酸纤维素  全部
背景技术：
禽流感病毒属正粘病毒科甲型流感病毒属。禽甲型流感病毒颗粒呈多形性，其中 球形直径80～120nm，有囊膜。基因组为分节段单股负链RNA。依据其外膜血凝素(H)和神经 氨酸酶(N)蛋白抗原性不同，目前可分为16个H亚型(H1～H16)和9个N亚型(N1～N9)。禽甲型 流感病毒除感染禽外，还可感染人、猪、马、水貂和海洋哺乳动物。可感染人的禽流感病毒亚 型为H5N1、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3，此次报道的为人感染H7N9禽流感病毒。该病毒为新型重 配病毒，其内部基因来自于H9N2禽流感病毒。 H7N9是禽流感的一种亚型。流感病毒颗粒外膜由两型表面糖蛋白覆盖，一H7N9型 为血细胞凝集素(即H)，一型为神经氨酸酶(即N)，H又分15个亚型，N分9个亚型。所有人类的 流感病毒都可以引起禽类流感，但不是所有的禽流感病毒都可以引起人类流感，禽流感病 毒中，H3、H5、H7、H9可以传染给人，其中H5为高致病性。H3为人犬共患，依据流感病毒特征可 分为HxNx共135种亚型，H7N9亚型禽流感病毒是其中的一种，既往仅在禽间发现，未发现过 人的感染情况。这个病毒的生物学特点、致病力、传播力，还没有依据进行分析判断。H7N9亚 型禽流感病毒是甲型流感中的一种，既往仅在禽间发现，未发现过人的感染情况。 临床表现：患者一般表现为流感样症状，如发热，咳嗽，少痰，可伴有头痛、肌肉酸 痛和全身不适。重症患者病情发展迅速，表现为重症肺炎，体温大多持续在39℃以上，出现 呼吸困难，可伴有咯血痰；可快速进展出现急性呼吸窘迫综合征、纵隔气肿、脓毒症、休克、 意识障碍及急性肾损伤等。 病原学检测：核酸检测，对患者呼吸道标本(如鼻咽分泌物、口腔含漱液、气管吸出 物或呼吸道上皮细胞)采用real  time  PCR(或RT-PCR)检测到H7N9禽流感病毒核酸。 胶体金免疫层析技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广 泛的应用。它是继传统三大免疫标记技术之后又一较为成熟的、得到广泛应用的免疫标记 技术。当待测样品加入到样品膜上后，由于微孔滤膜的毛细管作用，使抗原抗体反应在固相 膜上快速进行，检测一般只要5～10min就会出结果，相比其它方法，如ELISA需1～2h大大的 缩短了检测时间，相比RT-PCR不仅节省了时间还节约了成本。其测试结果以肉眼可见的显 色条带来判断，不需要特别仪器设备，只需要试纸或渗滤试剂盒，样品只要做非常简单的处 理或不需要做前处理。且具有成本较低、操作简单、试剂稳定不受温度等外界因素影响、方 便快捷、特异敏感、稳定性强、结果判断直观等优点，因而特别适合于现场快速检查，具有巨 大的发展潜力和广阔的应用前景，代表了诊断试剂简单快速、便于普及的发展方向。 中国专利文献CN201320384852.6公开了一种H7亚型禽流感病毒胶体金试纸，所述 试纸由样品垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接在底板上构成，所述硝酸纤维 素膜的检测区包被有H7亚型禽流感病毒外模血凝素抗原的单克隆抗体，硝酸纤维素膜的质 4 CN 111551745 A 说　明　书 2/6 页 控区包被有抗鼠IgG抗体，所述玻璃纤维膜(结合垫)上包被胶体金颗粒标记的H7亚型禽流 感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体。 中国专利文献CN201410052927.X公开了一种检测H7亚型禽流感病毒的胶体金试 纸，该试纸的检测线包被有H7亚型禽流感病毒多克隆抗体，质控线包被有兔抗鼠IgG，所述 结合垫包被胶体金颗粒标记的H7亚型禽流感病毒单克隆抗体。 上述两篇文献均是针对禽流感亚型病毒的检测，对于禽流感亚型病毒抗体的检 测，中国专利文献CN201220334257.7也有报道，具体公开了一种检测H5亚型禽流感病毒抗 体、新城疫病毒抗体和鸡法氏囊病毒抗体的胶体金测试试纸，其中所述检测线包被H5亚型 禽流感病毒的蛋白抗原，质控线包被羊抗兔IgG抗体，结合垫上包被胶体金颗粒标记的兔抗 鸡IgG抗体。但目前针对H7N9亚型的抗体检测没有相关报道。
技术实现要素：
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种禽流感病毒H7N9亚型N蛋白 IgY抗体检测胶体金试纸及方法，以提高禽流感病毒H7N9亚型N蛋白IgY抗体检测的灵敏度 和线性范围。 本发明通过以下技术方案来实现上述目的： 本发明提供了一种禽流感病毒H7N9亚型N蛋白IgY抗体检测胶体金试纸，包括PVC 底板，及依次搭接在PVC底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中，所述结合 垫为包被有兔抗鸡IgG-胶体金复合物的胶体金垫，所述硝酸纤维素膜上设有由山羊抗兔 IgG包被的质控线和H7N9重组抗原包被的检测线。 作为本发明的进一步优化方案，由于H7N9亚型N蛋白序列不同地方有一定差异，本 发明在检测线上包被2种H7N9重组抗原，以提高检测的线性范围和灵敏度。 本发明还提供了上述禽流感病毒H7N9亚型N蛋白IgY抗体检测胶体金试纸的制备 方法，包括以下步骤： (1)制备纯化的H7N9重组抗原； (2)制备硝酸纤维素膜：将山羊抗兔IgG和纯化的H7N9重组抗原分别稀释后，包被 在硝酸纤维素膜的质控线和检测线上； (3)制备胶体金； (4)胶体金标记兔抗鸡IgG：取兔抗鸡IgG，将胶体金与兔抗鸡IgG混合，离心，用胶 体金稀释液重悬沉淀，获得兔抗鸡IgG-胶体金复合物； (5)制备胶体金垫：将兔抗鸡IgG-胶体金复合物均匀喷在结合垫上，充分干燥，获 得胶体金垫； (6)样品垫的处理：将样品垫浸泡在20mmol/L的PBS缓冲液中2-5小时，并且边震荡 边混匀，其中缓冲液中加入一定量的活化剂，例如PEG6000、PEG8000、Tween20以及曲拉通 100中的一种，用量一般为1％～2％质量百分比；浸泡结束后，将样品垫放入烘箱中烘干； (7)组装：在干燥环境下，将样品垫、胶体金垫、包被好的硝酸纤维素膜和吸水垫粘 贴在PVC板上，裁切后，获得试纸。 作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(1)包括制备2种纯化的H7N9重组抗原 H7N9-A，H7N9-B，步骤包括：根据H7N9重组抗原H7N9-A，H7N9-B蛋白基因序列制备H7N9亚型N 5 CN 111551745 A 说　明　书 3/6 页 蛋白的大肠杆菌重组菌，将重组菌进行发酵表达并离心获得菌体，将菌体超声破碎，离心后 取上清，将上清液过亲和层析柱，即为纯化的H7N9-A，H7N9-B重组抗原。 作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(2)中，山羊抗兔IgG和纯化的H7N9重组 抗原分别以50mM的Tris-NaCl缓冲液稀释至终浓度为1mg/ml，再以0.75μL/cm的喷量喷施包 被在质控线和检测线上，充分干燥。 作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(3)中，制备胶体金的方法为柠檬酸三钠 还原法，步骤包括： (Ⅰ)取质量分数为0.005％-0.015％的HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸； (Ⅱ)迅速加入质量分数为0.5％-5％的柠檬酸三钠水溶液1ml，继续煮沸，溶液由 淡黄色变成灰色，继而转成黑色，随后逐渐稳定成酒红色，制成胶体金溶液。 作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(4)中，胶体金标记兔抗鸡IgG的步骤包 括： (i)取兔抗鸡IgG溶于0.1-0.2ml  10mM的缓冲液中，将胶体金溶液的pH值调至7.2； (ii)每20-50mg兔抗鸡IgG中，加入10ml胶体金溶液； (iii)混合3-5min后，加入质量分数为0.05％的BSA，室温作用结合15min； (iv)先2000r/min低速离心15min，再12000r/min高速离心25min； (v)用100mmol/L的pH7.8的含0.2％质量分数Proclin300的缓冲液重悬沉淀，获得 兔抗鸡IgG-胶体金复合物。 作为本发明的进一步优化方案，所述缓冲液为Tris缓冲液、PBS缓冲液或Hepes缓 冲液。 作为本发明的进一步优化方案，兔抗IgG-胶体金复合物在玻璃纤维素膜上的喷量 为10μL/cm。 本发明还提供了利用上述禽流感病毒H7N9亚型N蛋白IgY抗体检测胶体试纸检测 禽流感病毒H7N9亚型N蛋白IgY抗体的方法，包括以下步骤： 步骤一、将试纸平放，取待测血清样品50-100μL，加入样品垫； 步骤二、室温静置15min后，判断：若质控线出现紫红色线且检测线不出现色线，为 阴性；若质控线和检测线都出现紫红色线，为阳性；检测线的颜色深浅与抗体滴度成正比。 本发明的有益效果在于：本发明提供了一种H7N9  IgY抗体胶体金检测试纸及方 法，利用检测试纸检测后，阳性结果说明所检测样本H7N9  IgY抗体阳性且达到了要求的抗 体水平，阴性结果说明样本H7N9  IgY抗体阴性或未达到要求的抗体水平，该试纸可迅速检 测H7N9  IgY抗体水平，尤其是为了提高检测的灵敏度和线性范围，特制备了2种纯化的H7N9 重组抗原。相比较常规ELISA抗体检测方法，本发明更加的方便快捷。 附图说明 图1是H7N9  IgY抗体免疫胶体金检测试纸结构示意图。