技术摘要：
本发明公开一种基于高场核磁共振技术检测多肽药物结构的方法，涉及多肽药物及其它功能多肽结构检测领域，通过对无标记的多肽样品进行一维核磁共振和二维核磁共振，提取多肽的化学位移归属和空间距离约束和二面角约束，统计距离约束的使用情况，统计结构的角度和距离约  全部
背景技术：
目前人们已经发现了超过7000个天然多肽在人体荷尔蒙的活动、神经物质的传 导、生长因子、离子通道配体和抗感染等生理功能中发挥着关键作用。多肽一般作为高选择 性和高效性的信号分子与细胞表面受体或离子通道等相互作用，从而激发细胞内分子的生 物功能(Padhi  A .,et  al .Tuberculosis ,2014 ,94 ,363-373；Buchwald  H .,et  al.Surg .Obes.Relat.Dis.,2014,10(5) ,780-786；Glordano  C.et  al.,Front.Neurol., 2014,5,63；Robinson  S.D.,et  al.,PLOSONE,2014,9,e87648)。多肽作为药物，与传统的小 分子药物相比，它具有高安全性、高耐受性和高效性的特点；与蛋白质药物相比，它的产物 复杂性更低。因此，目前多肽药物是一个新兴并具有很强吸引力的领域。目前大于有140个 多肽药物在进行临床测试(Fosgerau  K.,et  al.,Drug  Discovery  Today,2015,20,122- 128)。而药物的研发与申报，清楚的解析其结构是前提。多肽药物除具有一级序列结构信息 外，还具有三维的空间结构信息，且空间结构信息需要在一定的体系中才能够维持，因此对 于多肽药物来说，要得到其在近似生理环境下的空间结构才具有实际的使用意义。 液体核磁共振技术作为一种常规的化合物鉴别手段，已经广泛应用于生物、化学、 医药、农业等等诸多领域。相对于X-ray晶体衍射技术和低温冷冻电镜技术等其他结构研究 的手段来说，液体核磁共振技术研究体系是液体环境，更接近研究对象的真实体系，这一点 对于多肽药物来说尤为重要，即液体核磁共振技术可以完成在近似生理环境下研究多肽药 物的空间结构。目前使用核磁共振仪器研究多肽药物结构的方法主要有两大类：一类是将 其视作传统的药物小分子来研究，这样使用非标记的样品和简单的一维和二维核磁实验来 完成。这类方法的优点是样品和实验都比较简单，成本低，但相对于小分子来说，多肽分子 量较大，氨基酸种类也不是很多，导致信号重叠比较严重，并且缺乏三维结构的计算方法， 最终往往无法得到真实的三维空间结构，结果常以对比样品和标准品核磁共振谱图的形式 表述。另一类是以核磁共振研究蛋白质结构的方法来研究多肽结构，使用同位素标记的样 品和核磁共振三维实验来解析三维结构。此类方法的优点是一旦拿到样品就能够得到较好 的三维结构，但是多肽样品需要进行同位素标记。如果通过生物合成的方法进行标记，不仅 成本高，而且纯化过程往往比蛋白质纯化还复杂，如果用化学合成的方法标记，所用的所有 试剂都需要用同位素标记的试剂，再考虑到每一步合成产率的问题，成本高到绝大多数的 研究者无法负担。另外，此类方法需要采集三维的核磁共振实验，使用的机时较多，往往一 个样品需要一周以上的时间，测试的成本也较高。
技术实现要素：
本发明的目的是提出一种基于高场核磁共振技术检测多肽药物结构的方法，能够 3 CN 111595888 A 说　明　书 2/5 页 使用低成本、简单非标记的样品和简单的一维(1D)和二维(2D)核磁共振实验，得到多肽药 物的三维空间结构。 针对上述目的，本发明通过以下技术方案实现： 一种基于高场核磁共振技术检测多肽药物结构的方法，包括以下步骤： 谱图采集和分析：采集多肽样品的核磁共振2D  1H-1H  TOCSY谱、2D  1H-1H  COSY谱、 2D  1H-13C  HSQC谱和2D  1H-1H  NOESY谱；分析谱图，提取多肽的化学位移归属和空间距离约 束，并根据化学位移归属提取二面角约束 结构计算：分析NOESY谱图中提取的氢原子之间的距离约束信息，计算得到多肽样 品的在真空中的结构作为初始结构，对该初始结构进行优化，得到多肽样品在溶剂存在下 的空间结构；根据该空间结构统计距离约束的使用情况，并计算结构的均方根偏差、能量数 据和拉氏图数据，以及统计结构的角度和距离约束的违约情况，得到多肽药物的三维结构。 进一步地，多肽样品采集方法为：将多肽固体粉末溶于不同的缓冲体系，制备不同 缓冲体系的多肽样品，完成所有多肽样品的核磁共振1D  1H谱实验，分析比较不同缓冲体系 下1D1H谱，选出信号符合要求的样品进行后续实验，提高所采集的2D谱图的分辨率。 进一步地，使用TALOS(Cornilescu  G .et  al.,J .Biomol.Biol.,1999,273,283- 298)软件根据化学位移归属提取二面角约束 进一步地，使用SANE(Duggan  B.,et  al.,J.Biomol.Biol.,2001,19,321-329)的 方法分析NOESY谱图中提取的氢原子之间的距离约束信息；优化CYANA(Guntert  P ,et  al .J .Mol .Biol .,1997 ,273 ,283-298)软件和AMBER (Pearlman  D .A .,et  al ., Comput.Phys.Commun.,1995,91,1-41)软件的输入文件格式，使之能够适应2D  NOESY中提 取的1H-1H距离约束的使用，使用CYANA软件计算得到多肽样品的在真空中的结构作为初始 结构，使用AMBER软件对初始结构进行优化，得到多肽样品在溶剂存在下的空间结构。 进一步地，缓冲体系的pH应为中性或弱酸性，体系中最好不含有除水分子外其它 的含H原子的分子，优选直接使用水或者不同盐浓度的PBS缓冲体系。 进一步地，提取氢原子之间的距离约束信息时使用所有包含NH和CH的距离信息。 进一步地，多肽样品的浓度大于1mM。 进一步地，根据多肽样品不同，使用仪器通常需要在700MHz以上。 进一步地，信号符合要求包括：H信号半高宽窄，即其值与多肽分子量匹配；分散性 好，即信号重叠较少，特别是化学位移在6-10ppm的主链氨基1H的信号个数应超过氨基酸个 数的80％，尤其是要重叠少。 进一步地，TOCSY实验的混合时间设置为80ms，NOESY实验的混合时间在300ms左右 (200-400ms)，具体视多肽的分子量确定，分子量较大时混合时间减少，反之亦然，实验采集 时可以采集不同混合时间的谱图进行比较，选择NOE信号强且信号没有明显多于混合时间 短的实验的NOE信号为最佳，如果NOESY信号弱且数量少的样品使用ROESY实验代替NOESY实 验。 进一步地，化学位移归属时，使用TOCSY、COSY和HSQC对氨基酸残基类型和化学位 移进行指认，NOESY谱图中可以找到所有氨基酸残基主链氨基H和前后氨基酸α位1H的NOE信 号，结合NOESY实验确定氨基酸残基之间的序列连接信息。 进一步地，距离约束的使用情况包括确定的约束的使用数量和模糊计算的距离约 4 CN 111595888 A 说　明　书 3/5 页 束的使用数量，确定的约束的使用数量包括中长程距离约束的使用数量；结构的均方根偏 差包括分子中主链原子和重原子的均方根偏差；能量数据包括计算的amber能量、距离约束 和角度约束的违约能量。 本发明首先使用高场核磁共振仪器(≧700MHz，具体视样品分子量大小等条件而 定)采集了样品不同缓冲体系下的1D1H谱，通过解析谱图能够最好维持多肽药物空间结构 的缓冲体系的条件。其次，采集多肽药物的2D  1H-1H  TOCSY谱、2D  1H-1H  COSY谱和2D  1H- 13CHSQC谱，并解析谱图得到多肽药物结构的化学位移归属。采集2D  1H-1H  NOESY谱图，提取 出距离约束信息。最后，将CYANA和AMBER的输入脚本进行优化，使之能适用于二维谱图的数 据分析计算，最终解析出三维的多肽药物结构，并汇总结果统计的结果。 相较于现有的技术，本发明的有益效果如下： 本发明提供了一种基于高场核磁共振技术高效并低成本检测多肽药物结构的方 法，与上文提到的两种传统的方法相比，该方法使用的是低成本易获取的多肽样品进行检 测，该多肽样品不需要特殊标记，且仅需花费较少的时间采集少量的谱图就能满足解析三 维结构的需要，大大节约了样品制备和核磁谱图解析的时间和成本。并且，通过对具体计算 方法的优化，可以使用蛋白质结构计算的软件完成非标记样品三维结构的解析，从而得到 更接近生理条件下的多肽药物三维空间结构，为药物的研发、申报和审批等提供可靠的三 维结构信息。 附图说明 图1是多肽药物三维结构解析流程图。 图2是实施例检测的齐考诺肽的1D  1H谱图。 图3是CYANA和AMBER软件优化后距离约束文件范例。 图4是实施例检测的齐考诺肽的三维结构图。