技术摘要：
本发明提供一种耐淹柳树新品种快速育种方法，包括：(1)设定耐淹指数分级；(2)对柳树杂交群体子代进行分级；(3)选取0级以及3或4级的枝条生根萌芽后进行水淹胁迫，并设对照，取根系与枝芽组织混合样测序，在柳树全基因组数据库中筛选初步耐淹候选基因，从中选择50个以上  全部
背景技术：
柳树是杨柳树柳属与钻天柳属植物的总称：如旱柳Salix  matsudana  Koidz.、腺 柳Salix  chaenomeloides  Kimura、垂柳Salix  babylonica  Linn等。柳树有乔木与灌木之 分，一般雌雄异株，。 柳属世界约520多种，主产北半球温带地区，寒带次之，热带和南半球极少，大洋洲 无野生种。我国有257种，122变种，33变型。 柳树对环境的适应性很广，喜光，喜湿，耐寒，是中生偏湿树种。但一些种也较耐旱 和耐盐碱，在生态条件较恶劣的地方能够生长，在条件优越的平原沃野，生长更好。一般寿 命为20～30年，少数种可达百年以上。一年中生长期较长，发芽早，落叶晚，南方个别种为常 绿树。 柳树通常栽种在河边、湖边，为了提高柳树的耐淹能力，需要培育耐淹柳树新品 种，但是采用常规育种方法培育耐淹柳树新品种耗时太长。 因此，希望提供一种耐淹柳树新品种快速育种方法，其能够培育耐淹柳树新品种， 且育种迅速，准确性好。
技术实现要素：
为了克服上述现有技术中的缺点，本发明的一个目的在于提供一种耐淹柳树新品 种快速育种方法，其能够培育耐淹柳树新品种，且育种迅速，准确性好，适于大规模推广应 用。 本发明的另一目的在于提供一种耐淹柳树新品种快速育种方法，其设计巧妙，操 作简便，成本低，适于大规模推广应用。 为达到以上目的，本发明提供一种耐淹柳树新品种快速育种方法，其特点是，包括 以下步骤： (1)设定柳树的耐淹指数的分级： 0级：水淹30天时所述柳树没有枝条萌芽萌根； 1级：水淹30天时所述柳树部分枝条萌芽但不萌根； 2级：水淹30天时所述柳树所有枝条萌芽但不萌根； 3级；水淹30天时所述柳树所有枝条萌芽且部分萌根； 4级；水淹30天时所述柳树所有枝条萌芽且萌根； (2)选取柳树杂交群体子代每种植株的多根枝条，将所述枝条完全浸没在水中，根 据所述耐淹指数对所述植株进行分级； (3)选取所述耐淹指数为0级以及3级或4级的所述植株的另外的枝条在无土条件 4 CN 111567399 A 说　明　书 2/5 页 下生根萌芽，用水冲洗后浸入水中进行水淹胁迫，并设对照，取所述水淹胁迫后的所述枝条 的根系与枝芽组织混合样进行转录组测序，根据测序的差异表达基因数据信息在柳树全基 因组数据库中筛选初步耐淹候选基因，从所述初步耐淹候选基因中选择50个以上耐淹候选 基因； (4)针对所述耐淹候选基因，对所述根系与枝芽组织混合样进行RNA提取、反转录 和qRT-PCR鉴定，根据基因上调表达量差异对所述耐淹候选基因进行排序，对排序后的所述 耐淹候选基因的启动子序列进行分离与分析，筛选所述启动子序列中出现碱基多次缺失或 插入或出现耐淹相关SNP的目标耐淹候选基因； (5)将所述目标耐淹候选基因进行转基因获得过量表达转基因植株进行耐淹胁迫 实验，和对照野生型比较验证所述目标耐淹候选基因功能并最终确认10个耐淹检测标记基 因； (6)将待检测柳树杂交群体子代采用所述步骤(3)的方法获得的所述根系与枝芽 组织混合样与所述待检测柳树杂交群体子代的正常生长的所述根系与枝芽组织混合样用 所述耐淹检测标记基因进行qRT-PCR表达量检测，如果有5个以上所述耐淹检测标记基因表 达量出现显著上调，对应的柳树植株即为候选耐淹柳树新品种，将所述候选耐淹柳树新品 种按所述步骤(2)进行所述耐淹指数分级，如果所述耐淹指数为3级或4级，则所述候选耐淹 柳树新品种为耐淹柳树新品种。 较佳地，在所述步骤(2)中，所述枝条长10cm，所述枝条粗细一致，所述枝条带有3 个嫩芽，所述枝条的上端和下端均平剪。 较佳地，在所述步骤(2)中，所述枝条离所述水的水面的距离为1cm。 较佳地，在所述步骤(2)中，所述枝条的数目为30根，30根所述枝条分成3组作为3 个重复。 较佳地，在所述步骤(3)中，所述生根萌芽的时间为20天。 较佳地，在所述步骤(3)中，所述水淹胁迫为2小时、6小时、12小时3个不同时段的 水淹胁迫。 较佳地，在所述步骤(3)中，所述柳树全基因组数据库是柳树全基因组GO库与KEGG 库。 较佳地，在所述步骤(3)中，通过查询文献缩小所述初步耐淹候选基因的候选范围 从而从所述初步耐淹候选基因中选择50个以上所述耐淹候选基因。 较佳地，在所述步骤(3)中，所述耐淹候选基因的数目为50个。 较佳地，在所述步骤(4)中，其中一个所述目标耐淹候选基因为AP2基因，所述AP2 基因的启动子部分序列如SEQ  ID  NO:1所示。 本发明的有益效果主要在于： 1、本发明的耐淹柳树新品种快速育种方法包括以下步骤：(1)设定耐淹指数分级； (2)对柳树杂交群体子代进行分级；(3)选取0级以及3级或4级的枝条生根萌芽后进行水淹 胁迫，并设对照，取根系与枝芽组织混合样测序，在柳树全基因组数据库中筛选初步耐淹候 选基因，从中选择50个以上耐淹候选基因；(4)对根系与枝芽组织混合样进行qRT-PCR鉴定， 筛选目标耐淹候选基因；(5)转基因并进行耐淹胁迫实验，确认10个耐淹检测标记基因；(6) 将待检测柳树杂交群体子代的耐淹胁迫的根系与枝芽组织混合样进行qRT-PCR表达量检 5 CN 111567399 A 说　明　书 3/5 页 测，如果有5个以上耐淹检测标记基因表达量出现显著上调，且耐淹指数为3级或4级，则为 耐淹柳树新品种，因此，其能够培育耐淹柳树新品种，且育种迅速，准确性好，适于大规模推 广应用。 2、本发明的耐淹柳树新品种快速育种方法包括以下步骤：(1)设定耐淹指数分级； (2)对柳树杂交群体子代进行分级；(3)选取0级以及3级或4级的枝条生根萌芽后进行水淹 胁迫，并设对照，取根系与枝芽组织混合样测序，在柳树全基因组数据库中筛选初步耐淹候 选基因，从中选择50个以上耐淹候选基因；(4)对根系与枝芽组织混合样进行qRT-PCR鉴定， 筛选目标耐淹候选基因；(5)转基因并进行耐淹胁迫实验，确认10个耐淹检测标记基因；(6) 将待检测柳树杂交群体子代的耐淹胁迫的根系与枝芽组织混合样进行qRT-PCR表达量检 测，如果有5个以上耐淹检测标记基因表达量出现显著上调，且耐淹指数为3级或4级，则为 耐淹柳树新品种，因此，其设计巧妙，操作简便，成本低，适于大规模推广应用。 本发明的这些和其它目的、特点和优势，通过下述的详细说明、附图和权利要求得 以充分体现，并可通过所附权利要求中特地指出的手段、装置和它们的组合得以实现。 附图说明 图1是本发明的柳树不同耐淹等级的主视示意图。