技术摘要：
本发明公开了建立替米考星对猪胞内劳森菌的PK‑PD同步模型的方法，包括：绘制猪胞内劳森菌在IPEC‑J2细胞中的生长曲线；测定替米考星对猪胞内劳森菌胞内和胞外最低抑菌浓度、防突变浓度及抗菌后效应，绘制体外和半体内胞内杀菌曲线；根据所测的猪胞内劳森菌半体内胞内  全部
背景技术：
胞内劳森菌(Lawsonia  Intracellularis，L.intracellularis)属于脱硫弧菌属， 革兰氏阴性菌，呈弧形弯曲状、逗点状或S形，大小为1.25～1.75μm×0.25～0.43μm，专性寄 生于动物肠道细胞中，可引起以回肠和结肠隐窝内未成熟的肠细胞腺瘤样增生为特征的猪 增生性肠炎(PPE)。虽PPE死亡率不高，但该病可引起病猪腹泻、生长缓慢等临床症状，严重 降低动物的饲料利用率，进而造成巨大的经济损失。 随着猪增生性肠炎对抗生素的耐药日益严重，越来越多的药物已经不能用于临床 上对猪增生性肠炎的治疗，因此通过严谨的科学手段控制和减缓耐药性的产生和传播任重 道远。替米考星作为新型大环内酯类抗生素，对细胞膜有很强的渗透性，能较快透过细胞膜 达到胞内，具有良好的肠细胞内蓄积能力。此外胞内劳森菌的体外抑菌试验结果表明，替米 考星对胞内劳森菌具有比其他抗菌药物更强的抗菌活性。因此，替米考星可作为目前临床 胞内劳森菌感染的首选药物。为了科学有效使用替米考星在猪增生性肠炎治疗上的应用、 减缓其耐药性的产生，以及帮助我国兽医工作者在临床过程中有规可依，合理给药方案的 制定对于解决现有技术中药物使用不足之处具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的是提供建立替米考星对猪胞内劳森菌的PK-PD同步模型的方法，通 过测定替米考星对猪胞内劳森菌的药效学和在猪体内的药动学参数，制定出替米考星对猪 胞内劳森菌的合理给药方案，为科学养殖提供稳定的用药数据支持，能更科学的进行指导 临床用药，以及有效治疗猪增生性肠炎并对临床用药提供参考；能够在一定程度上有效缓 解猪胞内劳森菌对替米考星的耐药性产生，保护和维持替米考星的有效性；能够为药物对 胞内菌的PK-PD同步模型的研究提供指南。 为实现上述目的，本发明提供了如下方案： 本发明提供了建立替米考星对猪胞内劳森菌的PK-PD同步模型的方法，包括以下 步骤： 步骤1：测定替米考星对猪胞内劳森菌的药效学和在猪体内的药动学参数：采用荧 光定量PCR法计数，绘制猪胞内劳森菌在猪空肠上皮细胞IPEC-J2中的生长曲线。具体过程 为：将猪空肠上皮细胞铺于24孔板中，待细胞汇合度为60％左右时，加入胞内劳森菌(浓度 为5×105L.intracellularis/mL)，培养3h后，去除上清液，用PBS清洗3次，此时记为0h，更 换新鲜细胞培养基，分别在0、6、12、18、24h和2、3、4、5、6、7、8d取样，用荧光定量PCR测定细 菌的含量，绘制出胞内劳森菌的生长曲线。 采用过氧化物酶细胞单层染色法计数，测定替米考星对猪胞内劳森菌胞内和胞外 4 CN 111549156 A 说　明　书 2/8 页 最低抑菌浓度MIC。具体过程为：将猪空肠上皮细胞铺于24孔板中，待细胞汇合度为60％左 右时，加入胞内劳森菌(浓度为5×105L.intracellularis/mL)，培养24h后，去除上清液，用 PBS清洗3次；此后，每天更换成含有不同浓度(128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/ mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL)替米考星的细胞培养基，连续培养5天。 用过氧化物酶单层染色法染色计数，镜检，得到替米考星对猪胞内劳森菌胞内最低抑菌浓 度。 将胞内劳森菌(浓度为5×105L.intracellularis/mL)，加入含有不同浓度((128μ g/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL) 替米考星的细胞培养基中，作用3h后，将混合物加入含细胞汇合度为60％左右的24孔板中， 每天更换成不含药物浓度的培养基，连续培养5天；用过氧化物酶单层染色法染色计数，镜 检，得到替米考星对猪胞内劳森菌胞外最低抑菌浓度。 采用荧光定量PCR法计数，绘制替米考星对猪胞内劳森菌在猪空肠上皮细胞中的 体外和半体内胞内杀菌曲线。具体过程为：将猪空肠上皮细胞铺于24孔板中，待细胞汇合度 为60％左右时，加入猪胞内劳森菌(浓度为5×105L.intracellularis/mL)，培养3h后，去除 上清液，用PBS清洗3次；连续培养3天，使细菌浓度达到106L.intracellularis/mL后，以所 测定的替米考星对猪胞内劳森菌的胞内最低抑菌浓度为基准，加入不同浓度(0MIC、1/ 2MIC、1MIC、2MIC、4MIC、8MIC、16MIC)替米考星的细胞培养基，分别在0h、1h、2h、4h、8h、12h、 18h、24h、36h、48h取样，采用荧光定量PCR测定细菌的含量，绘制出胞内劳森菌的体外胞内 杀菌曲线。 半体内胞内杀菌曲线：由于药动学试验中采到的健康和患病猪的血浆和回肠内容 物都是给过药的，因此半体内就是要测药物在健康和患病的猪体内的杀菌特点，替米考星 在猪回肠内容物中对猪胞内劳森菌半体内胞内杀菌曲线的绘制与在替米考星对猪胞内劳 森体外胞内杀菌曲线的试验方法基本相同。不同的是在细胞培养基中添加不同浓度的替米 考星，使之与各个时间点所测回肠内容物中的药物浓度保持一致，随后直接加入胞内劳森 菌(浓度为5×105L .intracellularis/mL)孵育。分别在0h、1h、2h、4h、8h、12h、18h、24h、 36h、48h取样，采用荧光定量PCR测定细菌的含量，绘制出胞内劳森菌的半体内胞内杀菌曲 线。 采用荧光定量PCR法计数，测定猪胞内劳森菌在猪空肠上皮细胞中防突变浓度。具 体过程为：以所测定的替米考星对劳森菌的最低胞内抑菌浓度为基准，配制含不同浓度 (0MIC、1/2MIC、1MIC、2MIC、4MIC、8MIC、16MIC)替米考星的细胞培养基；将猪空肠上皮细胞 铺于24孔板中，待细胞汇合度为60％左右时，加入猪胞内劳森菌，培养3h后，去除上清液，用 PBS清洗3次；连续培养5天，使细菌浓度达到107L.intracellularis/mL后，经过离心和重悬 后，调节细菌的浓度，使细菌浓度达到约109L.intracellularis/mL，加入含有不同药物浓 度的细胞培养基，置于培养箱中培养5天；以培养5天后仍无菌落生长的最低药物浓度设为 初始防突变浓度(MPCpr)，再以MPCpr为基线，线性递减20％抗菌药物浓度，制备不同浓度(16 μg/mL、8μg/mL、7μg/mL、6.4μg/mL、6μg/mL、4μg/mL、2μg/mL)的含药细胞培养基，重复以上步 骤，放入培养箱培养5天后仍不出现菌落生长的最低药物浓度即为最终的MPC。 以及采用荧光定量PCR法计数，测定猪胞内劳森菌在猪空肠上皮细胞中抗菌后效 应。具体过程为：以所测定的替米考星对胞内劳森菌的最低胞内抑菌浓度为基准，配制含不 5 CN 111549156 A 说　明　书 3/8 页 同浓度(1MIC、2MIC、4MIC)替米考星的细胞培养基，将猪空肠上皮细胞铺于24孔板中，待细 胞汇合度为60％左右时，加入胞内劳森菌，培养3h后，去除上清液，用PBS清洗3次，连续培养 3天，使细菌浓度达到106L.intracellularis/mL后，加入含有不同药物浓度的细胞培养基， 置于培养箱中培养1h和2h，诱导PAE的产生；同时，设对照组两组A1、A2，只含有细胞和细菌 (无药物)。药物的去除和重建：实验组和对照组分别在1h和2h后，去除上清液，用PBS清洗3 次，立即放入培养箱中，此时为重建后的0h。细菌生长动力学曲线的建立：于重建后0、1、2、 4、6、8、12，24h，用荧光定量PCR测定各时间点的细菌含量，建立对照菌和实验菌重建后恢复 生长的动力学曲线，计算PAE。 步骤2：根据步骤1所测的替米考星对猪胞内劳森菌半体内胞内杀菌曲线，选择合 适的PK-PD参数，使用Winnolin软件模拟Sigmoid  Emax  PK-PD模型方程，计算替米考星对猪 胞内劳森菌不同抗菌效应下的药效学靶值，将替米考星达到不同抗菌效应目的所对应的药 效学靶值代入剂量计算方程中，计算得到抑菌、杀菌和根除下的给药剂量，制定出合理的给 药方案，建立替米考星对猪胞内劳森菌的PK-PD同步模型。 优选的是，所述猪胞内劳森菌为从疑似猪增生性肠炎的回肠病料中分离得到的菌 株，并经过PCR定性检测所述菌株和荧光定量PCR定量检测所述菌株的浓度。 优选的是，步骤1中替米考星对猪胞内劳森菌的药动学参数的获取包括以下步骤： 建立仔猪瘘管模型，设置实验组和对照组，用所分离的猪胞内劳森菌菌株对实验组进行攻 毒，建立人工感染猪胞内劳森菌的瘘管模型，两组动物均按照体重灌胃给药，给药后不同时 间点取血浆和回肠内容物，用高效液相色谱法检测血浆和回肠内容物中的替米考星药物浓 度。 优选的是，所述防突变浓度的测定，是以所测定的替米考星对劳森菌的最低胞内 抑菌浓度为基准，配制含不同浓度替米考星细胞培养基，经过观察5天后仍不出现菌落的最 低药物浓度为初始防突变浓度MPCpr，再以MPCpr为基线，线性递减20％抗菌药物浓度，制备 不同浓度的替米考星细胞培养基，并以5天后仍不出现菌落的最低药物浓度即为最终的 MPC。 优选的是，所述抗菌后效应是以所测定的替米考星对劳森菌的最低胞内抑菌浓度 为基准，配制含不同浓度替米考星细胞培养基，诱导PAE的产生，同时设只含有IPEC-J2和猪 胞内劳森菌的两个对照组，并实验组和对照组进行药物去除和重建，用荧光定量PCR测定不 同时间点的猪胞内劳森菌含量，建立对照组和实验组重建后恢复生长的动力学曲线，计算 PAE。 优选的是根据所测的替米考星对猪胞内劳森菌半体内胞内杀菌曲线，选择合适的 PK-PD参数，即(AUC/MIC)ex，使用Winnolin软件模拟Sigmoid  Emax  PK-PD模型方程，计算替米 考星对猪胞内劳森菌不同抗菌效应下的药效学靶值，将替米考星达到不同抗菌效应目的所 对应的(AUC/MIC)ex值代入剂量计算方程I中，求出替米考星达到不同抗菌效应时所需的给 药剂量： 6 CN 111549156 A 说　明　书 4/8 页 其中，公式I中，Dose表示给药剂量；(AUC/MIC)ex表示指对应不同治疗效应(杀菌、 抑菌和根除)的PK-PD参数值；CL指替米考星在猪消化道中清除率；F为生物利用度；MIC为猪 胞内劳森菌的胞内MIC值；fu表示游离药物浓度的比例。 本发明还提供由所述的建立替米考星对猪胞内劳森菌的PK-PD同步模型的方法制 定替米考星对猪胞内劳森菌的给药方案。 本发明公开了以下技术效果： 本发明通过临床上分离疑似为猪增生性肠炎的回肠病料得到猪胞内劳森菌，并绘 制猪胞内劳森菌生长曲线，测定替米考星对猪胞内劳森菌最低抑菌浓度、防突变浓度、抗菌 后效应、绘制体外和半体内胞内杀菌曲线，以及进行替米考星对猪体内的药动学研究；根据 所测的替米考星对猪胞内劳森菌半体内胞内杀菌曲线，选择合适的PK-PD参数(选择标准是 根据所测的替米考星对猪胞内劳森菌半体内胞内杀菌曲线，若随着药物浓度的增加，杀菌 作用增强，呈现显著的浓度依赖性，则选用AUC/MIC；若随着药物作用时间的增加，杀菌作用 增强，呈现显著的时间依赖性，则选用T>MIC)，拟合数据，制定替米考星对猪胞内劳森菌的 合理给药方案，建立替米考星对猪胞内劳森菌的PK-PD同步模型。通过本发明方法可以制定 出替米考星对猪胞内劳森菌的合理给药方案，为科学养殖提供稳定的用药数据支持，能更 科学地进行指导临床用药；能够在一定程度上有效缓解猪胞内劳森菌对替米考星的耐药性 产生，保护和维持替米考星的有效性，同时能够为抗菌药物对胞内菌的PK-PD同步模型的研 究提供指南。 附图说明 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所 需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施 例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获 得其他的附图。 图1为本发明中PCR定性检测分离菌株的结果； 图2为本发明中荧光定量PCR定量检测分离菌株的结果； 图3为本发明中猪胞内劳森菌在猪空肠上皮细胞中的生长曲线示意图； 图4为本发明中替米考星对猪胞内劳森菌在猪空肠上皮细胞中的胞内杀菌曲线示 意图； 图5为本发明中替米考星对猪胞内劳森菌在猪空肠上皮细胞中的胞外杀菌曲线示 意图； 图6为本发明中Mlxplore软件模拟不同给药方案下细菌的生长情况；其中，adm  1： 预防剂量：3.93mg/kg，2次/d；adm  2：治疗剂量：14 .20mg/kg，2次/d；adm  3：根除剂量： 21.50mg/kg，2次/d；adm  4:预防剂量：3.93mg/kg，1次/d；adm  5：治疗剂量：14.20mg/kg，1 次/天；adm  6：根除剂量：21.50mg/kg，1次/d。