技术摘要：
本申请提供一种转化微生物、以及包括培养该转化微生物的工序的包含3HH单体单元的共聚PHA的制造方法，所述转化微生物是生产以更高组成比率包含3HH单体单元的共聚PHA的转化微生物，具体而言，所述转化微生物具有能够合成包含3HH单体单元的共聚PHA的PHA合成酶基因、和编码 全部
背景技术：
聚羟基烷酸酯(PHA)是由广泛的微生物生成的聚酯型有机聚合物。PHA是具有生物 降解性的热塑性高分子，可以以可再生资源作为原料进行生产。鉴于这些情况，正在进行在 工业上生产PHA作为环保型材料或生物适应型材料并在多种产业中加以利用的尝试。 目前为止，已知大量微生物在菌体内蓄积PHA作为储能物质。作为PHA的代表例，可 列举出作为3-羟基丁酸(以下有时也称为“3HB”)的均聚物的聚-3-羟基丁酸酯(以下有时也 称为“P(3HB)”)。P(3HB)为热塑性高分子，且在自然环境中可被生物降解，因此作为环保的 塑料而备受关注。然而，由于P(3HB)的结晶性高，因此具有硬且脆的性质，实际上应用范围 受到限制。为了扩大应用范围，需要对P(3HB)赋予柔软性。 因此，开发出了由3HB和3-羟基戊酸(以下记为“3HV”)形成的共聚PHA(以下记为“P (3HB-共-3HV)”)及其制造方法(例如，专利文献1及专利文献2)。与P(3HB)相比，P(3HB-共- 3HV)更富有柔软性，因此可以认为能够用于广泛的用途。然而，实际上即使增加P(3HB-共- 3HV)中的3HV摩尔分数，与此相伴的物性变化也很小，且特别是柔软性不会提高至用于加工 成膜、片、软质包装容器等所需的程度，因此仅在洗发水瓶、一次性剃须刀的手柄等限于硬 质成型体的领域中得以利用。 为了进一步提高PHA的柔软性，对由3HB和3HH形成的共聚PHA(以下有时也称为“P (3HB-共-3HH)”)及其制造方法进行了研究(专利文献3及专利文献4)。在这些报告中，P (3HB-共-3HH)是使用从土壤中分离得到的豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)的野生株并 以油酸、棕榈酸等脂肪酸作为碳源进行发酵生产的。 还进行了有关P(3HB-共-3HH)的物性的研究(非专利文献1)。在该报告中，将碳原 子数为12个以上的脂肪酸作为唯一碳源对A.caviae进行培养，发酵生产了具有各种3HH组 成比的P(3HB-共-3HH)。明确了P(3HB-共-3HH)随3HH组成比的增加，从如P(3HB)那样的硬且 脆的性质逐渐显示出柔软的性质，当3HH组成比变得更高时，显示出超过P(3HB-共-3HV)的 柔软性。即，对于P(3HB-共-3HH)而言，通过改变3HH组成比，可以使其具有能够应用于从硬 质聚合物至软质聚合物的广泛的物性，因此可以期待用于广泛的领域。 另外，研究了以杀虫贪铜菌(Cupriavidus necator)作为宿主、并通过在质粒 pJRD215(ATCC37533)中导入了聚酯合成酶基因、R体特异性烯酰辅酶A水合酶基因等而成的 pJRDEE32、pJRDEE32d13等PHA合成酶表达质粒进行转化而得到的微生物的PHA生产性(专利 文献5及非专利文献2)。已知该菌株培养后的菌体量原本低至4g/L，但通过改善以植物油脂 作为碳源的相同菌株的培养条件，使聚合物生产性提高至菌体量为45g/L、聚合物含量为 3 CN 111615555 A 说 明 书 2/18 页 62.5％，而且3HH组成比提高至8.1mol％。这样，尝试了通过培养条件来改善P(3HB-共-3HH) 的3HH组成比、聚合物生产性(专利文献6)。 还报道了通过增强R体特异性烯酰辅酶A水合酶基因的表达而使3HH组成比提高 (专利文献7、专利文献8及非专利文献3)。在这些报告中，对于具有源自豚鼠气单胞菌的PHA 合成酶的杀虫贪铜菌，通过导入R体特异性烯酰辅酶A水合酶基因、或者通过增加宿主染色 体上的R体特异性烯酰辅酶A水合酶基因的表达量，从而使以植物油脂作为原料所生产的P (3HB-共-3HH)的3HH组成比率提高至最大14mol％左右。 另外，还报道了利用增强了编码β-酮硫解酶的bktB基因的表达的C.necator菌株、 并使用植物油和丁酸作为碳源来生产3HH组成比率提高至13mol％的P(3HB-共-3HH)的例子 (参照非专利文献4)。已知由bktB基因编码的β-酮硫解酶具有使碳原子数4的丁酰辅酶A与 碳原子数2的乙酰辅酶A缩合而生成作为3HH单体的前体的碳原子数6的β-酮己酰辅酶A的活 性，着眼于该缩合活性，还报道了通过增强β-酮硫解酶基因来提高P(3HB-共-3HH)的3HH组 成比率的尝试(非专利文献5及非专利文献6)。 现有技术文献 专利文献 专利文献1：日本特开昭57-150393号公报 专利文献2：日本特开昭59-220192号公报 专利文献3：日本特开平5-93049号公报 专利文献4：日本特开平7-265065号公报 专利文献5：日本特开平10-108682号公报 专利文献6：日本特开2001-340078号公报 专利文献7：PCT国际公开第2011/105379号 专利文献8：PCT国际公开第2015/115619号 非专利文献 非专利文献1：Y.Doi ,S .Kitamura ,H .Abe ,Macromolecules ,28 ,pp .4822-4823 (1995) 非专利文献2：T.Fukui,Y.Doi,J.Bacteriol,179,15,pp.4821-4830(1997) 非专利文献3：H.Arikawa,K.Matsumoto,Microb.Cell.Fact.,15,pp.184(2016) 非专利文献4：S.Satoetal.,J.Biosci.Bioeng.,120,pp.246-251(2015) 非专利文献5：T.Fukui,H.Abe,Y.Doi,Biomacromolecules,3,pp.618-624(2002) 非专利文献6：Q.Wangetal .,Appl .Microbiol .Biotechnol .,99 ,pp.2593-2602 (2015)
技术实现要素：
发明所要解决的课题 本发明的目的在于提供生产以更高的组成比率包含3HH单体单元的共聚PHA的转 化微生物、以及使用了以油脂或脂肪酸(优选为植物来源的油脂或脂肪酸)作为原料的该转 化微生物的共聚PHA的制造方法。 用于解决课题的方法 4 CN 111615555 A 说 明 书 3/18 页 本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现，通过抑制编码对碳 原子数6的β-酮脂酰辅酶A(即，β-酮己酰辅酶A)具有硫解活性的至少1种、或至少2种的β-酮 硫解酶的基因的表达，使该酶活性消失或降低，能够进行以更高的组成比率包含3HH单体单 元的共聚PHA的发酵生产，从而完成了本发明。 即，本发明涉及一种转化微生物，其包含能够合成包含3HH单体单元的共聚PHA的 PHA合成酶基因、和编码具有R体特异性烯酰辅酶A水合酶(烯酰CoA水合酶)活性的蛋白质的 基因，所述转化微生物抑制编码对作为碳原子数6的β-酮脂酰辅酶A的β-酮己酰辅酶A具有 硫解活性的至少1种或至少2种β-酮硫解酶的基因的表达，使该酶活性消失或降低。 根据本发明的实施方式，本发明的转化微生物进一步使编码具有R体特异性烯酰 辅酶A水合酶活性的蛋白质的基因的表达增强。 根据本发明的实施方式，本发明的转化微生物进一步使能够合成包含3HH单体单 元的共聚PHA的PHA合成酶基因的表达增强。 本说明书中的基因的“表达抑制”是指，使上述β-酮硫解酶的活性消失或降低，表 达抑制包括使编码该酶的基因的功能消失。用于抑制表达的方法没有特别限定，例如可列 举出如下方法：编码上述β-酮硫解酶的基因的全部或部分的破坏(例如，利用基因组编集技 术(例如，CRISPR/Cas(例如，Cas9)系统、TALEN等)的基因的敲除、利用同源重组技术的基因 破坏、利用转位子的基因破坏等)、该基因的转录或翻译的效率的降低、与该基因转录相关 的启动子区域的修饰或与翻译相关的核糖体结合序列的修饰、使mRNA不稳定化的转录区域 碱基序列的修饰、RNA干扰导致的mRNA的降解或切断、该酶的底物特异性的改变等。另外，还 可以使用抑制该酶的活性的试剂、蛋白质等。 只要没有特别声明，本说明书中的基因的“破坏”是指，通过编码β-酮硫解酶的基 因的碱基序列的去除(或缺失)、切断、该碱基序列的缺失、置换、添加、插入等突变，而使由 该基因编码的酶蛋白本身被破坏的状态。 本说明书中的上述酶蛋白的活性的“降低”是指活性降低，使得共聚PHA的3HH单体 单元的组成比率高于酶活性未降低的对照。或者，优选上述酶蛋白的活性消失，作为相对于 完整的蛋白质的活性(100％)的相对活性，例如可以残留20％以下、10％以下、5％以下、2％ 以下或1％以下的弱活性，但并不限定于此。 本说明书中的基因表达的“强化”或“增强”是指该基因的表达量增加或提高。 根据本发明的实施方式，上述微生物优选为细菌(也称为bacteria)，更优选为属 于贪铜菌(Cupriavidus)属的细菌，进一步优选为杀虫贪铜菌(例如，杀虫贪铜菌 (Cupriavidus necator)H16株)。 根据本发明的实施方式，编码上述β-酮硫解酶的基因是选自源自杀虫贪铜菌H16 株的bktB基因或其同源物、以及源自杀虫贪铜菌H16株的A1528基因(基因编号“H16_ A1528”)或其同源物中的至少1种基因。 本说明书中使用的“同源物(homolog)”是指包括直向同源物(ortholog)及横向同 源物(paralog)中的任意一者，是编码具有同种或异种微生物所具有的β-酮硫解酶活性的 蛋白质的基因组。直向同源物及横向同源物具有学术上通常使用的含义，直向同源物是在 物种分化时分支的同源物(相同体)，是指存在于不同微生物中的具有相同功能的基因组。 另一方面，横向同源物是由基因重复而产生的同源物。 5 CN 111615555 A 说 明 书 4/18 页 根据本发明的实施方式，编码上述β-酮硫解酶的基因为源自杀虫贪铜菌H16株的 bktB基因或源自贪铜菌属细菌(例如杀虫贪铜菌)的该bktB基因的同源物、源自杀虫贪铜菌 H16株的A1528基因或源自贪铜菌属细菌(例如杀虫贪铜菌)的该A1528基因的同源物，或者 为这两者。 根据本发明的实施方式，上述bktB基因包含序列号7所示的碱基序列或与该碱基 序列具有85％以上的序列同一性的碱基序列，并且上述A1528基因包含序列号8所示的碱基 序列或与该碱基序列具有85％以上的序列同一性的碱基序列。 本发明还涉及包含3HH单体单元的共聚PHA的制造方法，该方法包括：使用含有油 脂或脂肪酸(优选为植物来源的油脂或脂肪酸)的碳源来培养上述转化微生物的工序、以及 对包含3HH单体单元的共聚PHA进行回收的工序。该共聚PHA优选为P(3HB-共-3HH)(别称聚 (3-羟基丁酸酯-共-3-羟基己酸酯))。 本说明书包括作为本申请的优先权基础的日本专利申请号2018-005998号的公开 内容。 发明的效果 根据本发明，可以提供生产包含更高组成比率的3HH单体单元的共聚PHA的转化微 生物，另外，通过培养该转化微生物，能够发酵生产包含更高组成比率的3HH单体单元的共 聚PHA。这样的共聚PHA具有柔软性提高的优点。
本申请提供一种转化微生物、以及包括培养该转化微生物的工序的包含3HH单体单元的共聚PHA的制造方法，所述转化微生物是生产以更高组成比率包含3HH单体单元的共聚PHA的转化微生物，具体而言，所述转化微生物具有能够合成包含3HH单体单元的共聚PHA的PHA合成酶基因、和编码 全部
背景技术：
聚羟基烷酸酯(PHA)是由广泛的微生物生成的聚酯型有机聚合物。PHA是具有生物 降解性的热塑性高分子，可以以可再生资源作为原料进行生产。鉴于这些情况，正在进行在 工业上生产PHA作为环保型材料或生物适应型材料并在多种产业中加以利用的尝试。 目前为止，已知大量微生物在菌体内蓄积PHA作为储能物质。作为PHA的代表例，可 列举出作为3-羟基丁酸(以下有时也称为“3HB”)的均聚物的聚-3-羟基丁酸酯(以下有时也 称为“P(3HB)”)。P(3HB)为热塑性高分子，且在自然环境中可被生物降解，因此作为环保的 塑料而备受关注。然而，由于P(3HB)的结晶性高，因此具有硬且脆的性质，实际上应用范围 受到限制。为了扩大应用范围，需要对P(3HB)赋予柔软性。 因此，开发出了由3HB和3-羟基戊酸(以下记为“3HV”)形成的共聚PHA(以下记为“P (3HB-共-3HV)”)及其制造方法(例如，专利文献1及专利文献2)。与P(3HB)相比，P(3HB-共- 3HV)更富有柔软性，因此可以认为能够用于广泛的用途。然而，实际上即使增加P(3HB-共- 3HV)中的3HV摩尔分数，与此相伴的物性变化也很小，且特别是柔软性不会提高至用于加工 成膜、片、软质包装容器等所需的程度，因此仅在洗发水瓶、一次性剃须刀的手柄等限于硬 质成型体的领域中得以利用。 为了进一步提高PHA的柔软性，对由3HB和3HH形成的共聚PHA(以下有时也称为“P (3HB-共-3HH)”)及其制造方法进行了研究(专利文献3及专利文献4)。在这些报告中，P (3HB-共-3HH)是使用从土壤中分离得到的豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)的野生株并 以油酸、棕榈酸等脂肪酸作为碳源进行发酵生产的。 还进行了有关P(3HB-共-3HH)的物性的研究(非专利文献1)。在该报告中，将碳原 子数为12个以上的脂肪酸作为唯一碳源对A.caviae进行培养，发酵生产了具有各种3HH组 成比的P(3HB-共-3HH)。明确了P(3HB-共-3HH)随3HH组成比的增加，从如P(3HB)那样的硬且 脆的性质逐渐显示出柔软的性质，当3HH组成比变得更高时，显示出超过P(3HB-共-3HV)的 柔软性。即，对于P(3HB-共-3HH)而言，通过改变3HH组成比，可以使其具有能够应用于从硬 质聚合物至软质聚合物的广泛的物性，因此可以期待用于广泛的领域。 另外，研究了以杀虫贪铜菌(Cupriavidus necator)作为宿主、并通过在质粒 pJRD215(ATCC37533)中导入了聚酯合成酶基因、R体特异性烯酰辅酶A水合酶基因等而成的 pJRDEE32、pJRDEE32d13等PHA合成酶表达质粒进行转化而得到的微生物的PHA生产性(专利 文献5及非专利文献2)。已知该菌株培养后的菌体量原本低至4g/L，但通过改善以植物油脂 作为碳源的相同菌株的培养条件，使聚合物生产性提高至菌体量为45g/L、聚合物含量为 3 CN 111615555 A 说 明 书 2/18 页 62.5％，而且3HH组成比提高至8.1mol％。这样，尝试了通过培养条件来改善P(3HB-共-3HH) 的3HH组成比、聚合物生产性(专利文献6)。 还报道了通过增强R体特异性烯酰辅酶A水合酶基因的表达而使3HH组成比提高 (专利文献7、专利文献8及非专利文献3)。在这些报告中，对于具有源自豚鼠气单胞菌的PHA 合成酶的杀虫贪铜菌，通过导入R体特异性烯酰辅酶A水合酶基因、或者通过增加宿主染色 体上的R体特异性烯酰辅酶A水合酶基因的表达量，从而使以植物油脂作为原料所生产的P (3HB-共-3HH)的3HH组成比率提高至最大14mol％左右。 另外，还报道了利用增强了编码β-酮硫解酶的bktB基因的表达的C.necator菌株、 并使用植物油和丁酸作为碳源来生产3HH组成比率提高至13mol％的P(3HB-共-3HH)的例子 (参照非专利文献4)。已知由bktB基因编码的β-酮硫解酶具有使碳原子数4的丁酰辅酶A与 碳原子数2的乙酰辅酶A缩合而生成作为3HH单体的前体的碳原子数6的β-酮己酰辅酶A的活 性，着眼于该缩合活性，还报道了通过增强β-酮硫解酶基因来提高P(3HB-共-3HH)的3HH组 成比率的尝试(非专利文献5及非专利文献6)。 现有技术文献 专利文献 专利文献1：日本特开昭57-150393号公报 专利文献2：日本特开昭59-220192号公报 专利文献3：日本特开平5-93049号公报 专利文献4：日本特开平7-265065号公报 专利文献5：日本特开平10-108682号公报 专利文献6：日本特开2001-340078号公报 专利文献7：PCT国际公开第2011/105379号 专利文献8：PCT国际公开第2015/115619号 非专利文献 非专利文献1：Y.Doi ,S .Kitamura ,H .Abe ,Macromolecules ,28 ,pp .4822-4823 (1995) 非专利文献2：T.Fukui,Y.Doi,J.Bacteriol,179,15,pp.4821-4830(1997) 非专利文献3：H.Arikawa,K.Matsumoto,Microb.Cell.Fact.,15,pp.184(2016) 非专利文献4：S.Satoetal.,J.Biosci.Bioeng.,120,pp.246-251(2015) 非专利文献5：T.Fukui,H.Abe,Y.Doi,Biomacromolecules,3,pp.618-624(2002) 非专利文献6：Q.Wangetal .,Appl .Microbiol .Biotechnol .,99 ,pp.2593-2602 (2015)
技术实现要素：
发明所要解决的课题 本发明的目的在于提供生产以更高的组成比率包含3HH单体单元的共聚PHA的转 化微生物、以及使用了以油脂或脂肪酸(优选为植物来源的油脂或脂肪酸)作为原料的该转 化微生物的共聚PHA的制造方法。 用于解决课题的方法 4 CN 111615555 A 说 明 书 3/18 页 本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现，通过抑制编码对碳 原子数6的β-酮脂酰辅酶A(即，β-酮己酰辅酶A)具有硫解活性的至少1种、或至少2种的β-酮 硫解酶的基因的表达，使该酶活性消失或降低，能够进行以更高的组成比率包含3HH单体单 元的共聚PHA的发酵生产，从而完成了本发明。 即，本发明涉及一种转化微生物，其包含能够合成包含3HH单体单元的共聚PHA的 PHA合成酶基因、和编码具有R体特异性烯酰辅酶A水合酶(烯酰CoA水合酶)活性的蛋白质的 基因，所述转化微生物抑制编码对作为碳原子数6的β-酮脂酰辅酶A的β-酮己酰辅酶A具有 硫解活性的至少1种或至少2种β-酮硫解酶的基因的表达，使该酶活性消失或降低。 根据本发明的实施方式，本发明的转化微生物进一步使编码具有R体特异性烯酰 辅酶A水合酶活性的蛋白质的基因的表达增强。 根据本发明的实施方式，本发明的转化微生物进一步使能够合成包含3HH单体单 元的共聚PHA的PHA合成酶基因的表达增强。 本说明书中的基因的“表达抑制”是指，使上述β-酮硫解酶的活性消失或降低，表 达抑制包括使编码该酶的基因的功能消失。用于抑制表达的方法没有特别限定，例如可列 举出如下方法：编码上述β-酮硫解酶的基因的全部或部分的破坏(例如，利用基因组编集技 术(例如，CRISPR/Cas(例如，Cas9)系统、TALEN等)的基因的敲除、利用同源重组技术的基因 破坏、利用转位子的基因破坏等)、该基因的转录或翻译的效率的降低、与该基因转录相关 的启动子区域的修饰或与翻译相关的核糖体结合序列的修饰、使mRNA不稳定化的转录区域 碱基序列的修饰、RNA干扰导致的mRNA的降解或切断、该酶的底物特异性的改变等。另外，还 可以使用抑制该酶的活性的试剂、蛋白质等。 只要没有特别声明，本说明书中的基因的“破坏”是指，通过编码β-酮硫解酶的基 因的碱基序列的去除(或缺失)、切断、该碱基序列的缺失、置换、添加、插入等突变，而使由 该基因编码的酶蛋白本身被破坏的状态。 本说明书中的上述酶蛋白的活性的“降低”是指活性降低，使得共聚PHA的3HH单体 单元的组成比率高于酶活性未降低的对照。或者，优选上述酶蛋白的活性消失，作为相对于 完整的蛋白质的活性(100％)的相对活性，例如可以残留20％以下、10％以下、5％以下、2％ 以下或1％以下的弱活性，但并不限定于此。 本说明书中的基因表达的“强化”或“增强”是指该基因的表达量增加或提高。 根据本发明的实施方式，上述微生物优选为细菌(也称为bacteria)，更优选为属 于贪铜菌(Cupriavidus)属的细菌，进一步优选为杀虫贪铜菌(例如，杀虫贪铜菌 (Cupriavidus necator)H16株)。 根据本发明的实施方式，编码上述β-酮硫解酶的基因是选自源自杀虫贪铜菌H16 株的bktB基因或其同源物、以及源自杀虫贪铜菌H16株的A1528基因(基因编号“H16_ A1528”)或其同源物中的至少1种基因。 本说明书中使用的“同源物(homolog)”是指包括直向同源物(ortholog)及横向同 源物(paralog)中的任意一者，是编码具有同种或异种微生物所具有的β-酮硫解酶活性的 蛋白质的基因组。直向同源物及横向同源物具有学术上通常使用的含义，直向同源物是在 物种分化时分支的同源物(相同体)，是指存在于不同微生物中的具有相同功能的基因组。 另一方面，横向同源物是由基因重复而产生的同源物。 5 CN 111615555 A 说 明 书 4/18 页 根据本发明的实施方式，编码上述β-酮硫解酶的基因为源自杀虫贪铜菌H16株的 bktB基因或源自贪铜菌属细菌(例如杀虫贪铜菌)的该bktB基因的同源物、源自杀虫贪铜菌 H16株的A1528基因或源自贪铜菌属细菌(例如杀虫贪铜菌)的该A1528基因的同源物，或者 为这两者。 根据本发明的实施方式，上述bktB基因包含序列号7所示的碱基序列或与该碱基 序列具有85％以上的序列同一性的碱基序列，并且上述A1528基因包含序列号8所示的碱基 序列或与该碱基序列具有85％以上的序列同一性的碱基序列。 本发明还涉及包含3HH单体单元的共聚PHA的制造方法，该方法包括：使用含有油 脂或脂肪酸(优选为植物来源的油脂或脂肪酸)的碳源来培养上述转化微生物的工序、以及 对包含3HH单体单元的共聚PHA进行回收的工序。该共聚PHA优选为P(3HB-共-3HH)(别称聚 (3-羟基丁酸酯-共-3-羟基己酸酯))。 本说明书包括作为本申请的优先权基础的日本专利申请号2018-005998号的公开 内容。 发明的效果 根据本发明，可以提供生产包含更高组成比率的3HH单体单元的共聚PHA的转化微 生物，另外，通过培养该转化微生物，能够发酵生产包含更高组成比率的3HH单体单元的共 聚PHA。这样的共聚PHA具有柔软性提高的优点。
