技术摘要：
本发明公开了一种全细胞转化制备葡萄糖二酸的方法，属于生物技术领域。以大肠杆菌为生产菌株，异源表达不同来源的葡醛酸脱氢酶，通过高密度发酵培养，获得蛋白过表达的大肠杆菌菌体细胞，以葡萄糖醛酸为底物生产葡萄糖二酸。本发明转化液成分单一，生产周期短，操作简  全部
背景技术：
葡萄糖二酸(Glucaric  acid，简称GA)是一种无毒的葡萄糖衍生物，天然存在于苹 果、柑橘等水果和西兰花、甘蓝等十字花科蔬菜中，在少量哺乳动物及人体内也有分泌(仇 钰莹,方芳,堵国成等.葡萄糖二酸研究进展[J].生物工程学报,2015,31(4):481-490)。葡 萄糖二酸被美国能源部评为“最具价值的生物炼制产品”可作为原料生产多种聚合物中间 体和生物新能源(袁海波,李江华,刘龙,等.基于系统生物学和合成生物学的重要平台化学 品生物制造的研究进展[J].化工学报,2016,67(21):129-139.)，也具有调节人体免疫系 统、减少人体内胆固醇的含量和调节体内某些激素的含量、保护肝脏的机能、减少癌症病发 可能的作用具有巨大的应用潜力和经济价值(Smith  T,Denton  T,Zhang  J.Synthesis  and  characterization  of  higher  molecular  weight  stereorandom  poly(D-glucaramides) from  1:1alkylenediammonium  D-glucaric  acid[C] .234th  ACS  National  Meeting , Boston,M  A,United  States,2007,79(15):225-227.)。 目前，国内外葡萄糖二酸的制备方法主要包括硝酸氧化、TEMPO氧化和微生物发酵 法，Sohst和Tollens(Sohst  O ,Tollens  B .Crystallized  saccharic  acid .Justus  Liebigs  Annalender  Chemie.Berlin:Verlag  Chemie,1888,245:1–27)报道了硝酸通过控 制反应程度将葡萄糖氧化成为葡萄糖二酸及小分子量有机酸。但是硝酸氧化工艺成本高、 条件苛刻、能耗大、成本高、得率低且安全性差，不能用于食品、药品等领域。Kochkar  H和 Lassalle  L(Kochkar  H,Lassalle  L,Morawietz  M,et  al.Regioselective  oxidation  of  hydroxyl  groups  of  sugar  and  its  derivatives  using  silver  catalysts  mediated  by  TEMPO  and  peroxodisulfate  in  water.J  Catal,2000,194(2):343–351.)报道了利用 2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧自由基(TEMPO)介导的电化学氧化葡萄糖合成葡萄糖二酸的方 法，虽然TEMPO氧化法比较温和，但是催化剂价格昂贵且不易进行大规模生产，因此微生物 发酵法制备葡萄糖二酸目前也越来越受到研究者们的青睐，小西一诚(CA104080918A) ,在 大肠杆菌共同表达啤酒酵母中的肌醇-1-磷酸合酶(Inol)，小鼠肌醇加氧酶(MIOX)和丁香 假单胞菌的葡醛酸脱氢酶(Udh)，构建从葡萄糖生产葡萄糖二酸的合成途径；康振等(CN  104312935A)在毕赤酵母中共同表达了毕赤酵母的肌醇-1-磷酸合酶(Inol)，肌醇加氧酶 (MIOX)和臭恶假单胞菌的葡醛酸脱氢酶(Udh)，构建从葡萄糖生产葡萄糖二酸的合成途径； 但是微生物发酵法生产周期长、生产得率较低且后续分离提取较为困难，因此，需要开发一 种操作简便、条件温和、原料利用率高、转化率高且分离纯化成本低的葡萄糖二酸生产方 法。
技术实现要素：
鉴于此，本发明提供了一种全细胞转化制备葡萄糖二酸的方法，该基因工程菌是 3 CN 111593013 A 说　明　书 2/5 页 共同表达了氨基酸序列SEQ  ID  NO .1所示序列的假单胞菌菌株KENGFT3(Pseudomonas  synxantha  strain  KENGFT3)来源的Udh(GenBank:CP014868.1)基因和氨基酸序列SEQ  ID  NO .2所示序列的脆弱假单胞菌P121(Pseudomonas  fragi  strain  P121)来源的Udh (GenBank:CP013861.1)基因的大肠杆菌；使用该菌株进行全细胞转化制备葡萄糖二酸的方 法具有操作简单、转化率高且转化液成分单一有利于进行下一步的分离纯化的优点。 本发明的技术方案如下： 一种基因工程菌，该菌株是共同表达了氨基酸序列SEQ  ID  NO.1所示序列的假单 胞菌菌株KENGFT3(Pseudomonas  synxantha  strain  KENGFT3)来源的Udh(GenBank: CP014868.1)基因和氨基酸序列SEQ  ID  NO.2所示序列的脆弱假单胞菌P121(Pseudomonas  fragi  strain  P121)来源的Udh(GenBank:CP013861.1)基因的大肠杆菌；所述大肠杆菌为 BL21，或大肠杆菌XL1-Blue，或大肠杆菌Rosetta。 进一步的，所述基因工程菌的构建方法为：将假单胞菌菌株KENGFT3(Pseudomonas  synxantha  strain  KENGFT3)来源的Udh基因脆弱假单胞菌P121(Pseudomonas  fragi  strain  P121)来源的Udh基因通过连接酶连接到表达载体上，表达载体在表达宿主中表达， 所述表达载体为pETDuet-1，所述表达宿主为大肠杆菌，所述表达载体为pETDuet-1。 使用上述基因工程菌进行全细胞转化制备葡萄糖二酸的方法，过程为：将大肠杆 菌工程菌发酵培养，收集菌体，加入反应液进行全细胞转化，获得葡萄糖二酸。 使用上述基因工程菌进行全细胞转化制备葡萄糖二酸的方法，具体步骤如下： (1)种子培养：使用LB培养基对基因工程菌进行培养，获得种子液； (2)高密度培养：以1-2％的接种量将种子液接种至发酵培养基内进行高密度培 养，然后向其中加入诱导剂，继续培养，获得发酵液； (3)收集细胞：将步骤(2)的发酵液离心，收集得到菌泥Ⅰ，将菌泥Ⅰ用Tris-Hcl进行 洗涤、重悬后，再次离心，得到菌泥Ⅱ；菌泥Ⅱ为基因工程菌细胞； (4)利用步骤(3)得到的细胞加入反应液，进行全细胞转化，生成葡萄糖二酸。 优选的，在步骤(1)中，基因工程菌的培养温度为37℃，培养时间为12h。 优选的，在步骤(2)中，基因工程菌的培养温度为37℃，当发酵液OD600达到0.6～ 1.0时，添加诱导剂。 优选的，在步骤(2)中，所述诱导剂为IPTG，所述IPTG的添加量为0.4mM，诱导条件 为：诱导温度为26℃，诱导时间为18h。 优选的，在步骤(3)中，所述洗涤过程中使用的洗涤液为25mM  Tris-Hcl(pH  7.5)。 优选的，在步骤(4)中，所述细胞的添加量为5～10g/L。 优选的，在步骤(4)中，所述反应液包括3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)和底物，其中， 3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)的浓度为20.9g/L，底物的起始浓度为2g/L。 优选的，在步骤(4)中，所述反应液pH为6.5～7.5；所述全细胞转化条件为：37℃条 件下反应2～24h；所述底物为以葡萄糖醛酸或葡醛酸内酯。 与现有技术相比，本发明的有益效果： (1)本发明与化学催化生产葡萄糖二酸相比，生产过程温和，更环保，生产成本更 低。 (2)本发明与发酵法生产葡萄糖二酸相比，操作简单，转化率高且转化液成分单一 4 CN 111593013 A 说　明　书 3/5 页 有利于进行下一步的分离纯化。 (3)本发明将假单胞菌菌株KENGFT3(Pseudomonas  synxantha  strain  KENGFT3) 和脆弱假单胞菌P121(Pseudomonas  fragi  strain  P121)来源的Udh基因导入pETDuet-1载 体，构建pETDuet-2×Udh载体；相对于其他重组菌生产葡萄糖二酸，少了肌醇氧化酶MIOX限 速酶，使得葡萄糖二酸的产量有了明显的提高； (4)本发明中全细胞转化只用5～10g/L的菌体和MOPS缓冲溶液便可将2g/L的葡萄 糖醛酸转化成1.52g/L的葡萄糖二酸，转化液成分单一，转化液中葡萄糖二酸的浓度高，可 极大降低产品葡萄糖二酸后期分离提取成本。 附图说明 图1：重组菌株E.coli  BL21/pETDuet-2×Udh全细胞可溶性蛋白SDS-PAGE图； 图2：HPLC检测葡萄糖二酸的标样； 图3：HPLC检测重组菌pETDuet-2×Udh发酵液。