技术摘要：
本发明提供了一种芽孢杆菌CQN‑2高密度发酵培养方法，通过生长条件优化、碳源和氮源优化、单一金属离子选择、碳源、氮源和糖蜜浓度优化等步骤获得芽孢杆菌CQN‑2的高密度发酵培养方法，本发明通过多组对比实验，科学的确定适合芽孢杆菌CQN‑2生长的培养方法，有效提高  全部
背景技术：
芽孢杆菌CQN-2为解淀粉芽孢杆菌，是健康仿刺参肠道中分离得到的益生菌之  一，通过饲料添加芽孢杆菌CQN-2投喂仿刺参后，可显著提高仿刺参的增重率  和特定生长 率，同时可有效提高仿刺参抵御病原菌感染的抗病力。然而，对于  芽孢杆菌CQN-2的中试高 密度发酵培养方法一直未能确定。 基于上述一系列的问题，遂有以下技术方案的产生。
技术实现要素：
本发明的目的在于通过生长条件优化、碳源和氮源优化、单一金属离子选  择、碳 源、氮源和糖蜜浓度优化等步骤获得芽孢杆菌CQN-2的高密度发酵培养 方法，。 为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案： 本发明提供的一种芽孢杆菌CQN-2高密度发酵培养方法，所述培养方法包  括如下 步骤： S1、准备PDA加富培养基、LB固体培养基、发酵培养基、实验器材以及待  试验的菌 株； S2、首先进行菌株的扩大培养与保藏，保藏后取出菌株开始活化并将菌液  进行转 接跟发酵，在发酵过程中进行生长曲线的测定； S3、生长过程中进行条件优化，所需要优化的条件为培养基的pH、装液量  和发酵 时转接的接种量，培养基优化配制后进行活化、转接发酵并进行记录数  据和分析； S4、在优化过程中包括对碳源、氮源的优化、单一金属离子的选择、糖蜜  浓度的优 化，通过正交实验记录数据并分析，然后制定原始培养条件和最优培  养条件生长曲线的对 比效果； S5、在发酵罐中进行pH调控，后绘制发酵液OD600值与菌体重量的标准曲线，  计算 发酵完成后的菌体数量。 进一步的，步骤S1所述PDA加富培养基包括：马铃薯200g，葡萄糖20g，  蛋白胨3g， KH2PO4  1g，MgSO4  0.5g，维生素B1  0.1g，pH  7.0，加水至1000  mL；LB固体培养基包括：LB固 体培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl  10g，  琼脂20g，pH7.0，每1000mL；发酵培养基包括： 糖蜜20g，酵母粉20g，  KH2PO4  0.5g，MgSO4  0.5g，NaCl  0.3g，pH  7.0，每1000mL。 进一步的，所述实验器材包括：烧杯，量筒，锥形瓶，移液枪，枪头盒，  涂布棒，平 板，玻璃比色皿，离心管架。 进一步的，步骤S4中碳源、氮源的优化包括使用蔗糖、木糖、葡萄糖、可  溶性淀粉、 糊精，氮源使用细菌学蛋白胨、酵母膏、鱼粉蛋白胨、牛肉膏、NH4Cl、  NaNO2配制各组对比试 4 CN 111592996 A 说　明　书 2/8 页 验的培养基进行活化、转接以及发酵，记录数据并分析，  将发酵后的发酵液进行OD600值的 测定并将数据记录，进行分析比较得到最优的 碳源和氮源。 进一步的，所述单一金属离子的选择包括选择Fe2 、Fe3 、Zn2 、Ca2 、  Mn2 、Ba2 、Al3 ，通过培养基的配制进行活化、转接以及发酵，其中发酵时 的接种量按照前面实验得到的 最优条件进行接种，通过记录数据并分析得到对 生长条件有促进作用的金属离子。 进一步的，所述糖蜜浓度的优化包括配制糖蜜浓度不一的发酵培养基进行  活化、 转接以及发酵，其中发酵时的接种量按照前面实验得到的最优条件进行  接种，然后经过记 录数据并分析得到最优的糖蜜浓度。 进一步的，所述步骤S5中pH调控的过程包括按照最优培养基的配方配制  两份发 酵培养基于发酵罐中，经过活化发酵，选取其中一罐通过使用NaOH进  行pH的控制，另一罐 不用，设置发酵温度为30℃，转速为600rpm，需要调  节pH的发酵罐将pH设定为7.0。再以最 优接种量将活化完成的芽孢杆菌接种  至发酵罐中进行发酵。 进一步的，所述绘制发酵液OD600值与菌体重量的标准曲线包括取用多组发  酵液 加入离心管，将离心管于10000rpm，15℃离心沉淀菌体，然后用无菌水  重悬菌体清洗培养 基，于相同条件离心沉淀菌体，清洗2-3次，洗完成后，弃  掉离心管中余液，将离心管放到干 燥箱中进行干燥，干燥完成后称量离心管和  菌体的重量然后减去离心管自身重量即可得 到菌体的干重，然后使用得到的数  据绘制标准曲线。 进一步的，所述计算发酵完成后的菌体数量包括取适量OD600为72.5的发酵  液于 超净工作台中使用无菌水进行梯度稀释稀释至10-11，取稀释至10-9、10-10、  10-11，这三个梯 度的稀释液取100L进行平板涂布，每个梯度涂2～3个平板，注  意这里使用的固体培养基为 LB固体培养基，将涂布完成的平板于37℃培养箱 中倒置培养48h，培养完成后进行计数，计 算平均值即可得到菌体的总数量。 本发明与现有技术相比具有如下有益效果： 1、本发明通过生长条件优化、碳源和氮源优化、单一金属离子选择、碳源、  氮源和 糖蜜浓度优化等步骤获得芽孢杆菌CQN-2的高密度发酵培养方法； 2、本发明通过多组对比实验，科学的确定适合芽孢杆菌CQN-2生长的培  养方法， 有效提高芽孢杆菌CQN-2的存活率。 附图说明 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施  例或 现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述 中的附图仅仅是 本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付  出创造性劳动的前提下，还 可以根据这些附图获得其他的附图。 图1是本发明使用Minitab软件进行正交实验的设计表； 图2是本发明发酵液OD600值与菌体重量的标准曲线； 图3是芽孢杆菌CQN-2的生长曲线； 图4是本发明生长优化中，pH的优化结果图； 图5是本发明装液量优化的结果示意图； 图6是本发明对接种量的优化结果图； 5 CN 111592996 A 说　明　书 3/8 页 图7是本发明对碳源的优化结果对比图； 图8是本发明对氮源的优化结果对比图； 图9是本发明碳源浓度的优化结果图； 图10是本发明氮源浓度的优化结果图； 图11是本发明糖蜜浓度的优化结果图； 图12是本发明金属离子的优化结果图； 图13是本发明不同组别正交实验结果示意图； 图14是本发明正交实验的均值效应图； 图15是原始培养条件和最优培养条件生长曲线的对比示意图； 图16是发酵罐中pH对发酵过程的对比示意图； 图17是本发明发酵培养方法的流程示意图