技术摘要：
本发明公开了采用超高效液相色谱法同时检测12种抗氧剂和游离硫的方法，采用超高效液相色谱法分别对标准溶液和样品溶液进行梯度洗脱，得到标准溶液和样品溶液的色谱图，然后将样品溶液色谱图中各色谱峰与标准溶液色谱峰的保留时间进行对比，对样品溶液中的游离硫和12种 全部
背景技术：
胶塞是药品包装材料中重要的密封组件。为获得高弹性、高耐磨、抗腐蚀等优良性 能，需在其合成加工的过程中进行硫化，常用的硫化剂主要包括硫磺和含硫化合物等，使用 硫磺作为硫化剂时，不可避免会存在硫的残留。另一方面，为抑制或延缓胶塞的氧化过程， 通常会加入抗氧剂，常用的抗氧剂主要分为受阻酚类和亚磷酸酯类，主要包括抗氧剂BHT- COOH、抗氧剂1310、抗氧剂PTOP、2,4-DTBP、抗氧剂BHT-Q、抗氧剂TNPP、抗氧剂BHT、抗氧剂 3114、抗氧剂1010、抗氧剂330、抗氧剂1076、抗氧剂168等12种抗氧剂。研究表明，受阻酚类 抗氧剂（如抗氧剂BHT、抗氧剂1010、抗氧剂330、抗氧剂1076和对特辛基苯酚（PTOP）等）能在 人体类蓄积，是一类环境雌激素，会对人体的生殖系统等产生危害；常用的亚磷酸酯类有抗 氧剂168、TNPP等，抗氧剂168容易降解产生毒性更大的2,4-二叔丁基苯酚（2,4-DTBP）。在药 品的实际贮存和使用过程中，药品与胶塞直接接触，胶塞中的硫化剂和抗氧剂等均存在浸 出的风险，从而影响药物的安全性。所以十分有必要对药品中是否含有以上12中抗氧剂和 游离硫进行分析检测。 目前，主要是采用液相色谱法检测药品中的抗氧剂和游离硫，但传统的液相色谱 法采用5 μm粒径的色谱柱，存在柱效不高、分析时间较长、有机溶剂消耗量大的缺点。同时， 根据现有文献报道，采用液相色谱法同时测定多种抗氧剂和游离硫均需要40min以上分析 时间，分析效率低，并且每个样品消耗的流动相体积大于40mL，分析成本高。 超高效液相色谱（UPLC）借助高效液相色谱（HPLC）的理论和原理，涵盖了小颗粒填 料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容 量。具有分析时间段、溶剂用量少等优点，但是目前对于怎样利用超高效液相色谱同时检测 12种抗氧剂和游离硫鲜有报道。 因此，怎样利用超高液相色谱同时检测12种抗氧剂和游离硫，以提高分析效率，减 少溶剂用量，降低分析成本是本领域技术人员渴望解决的技术问题。
技术实现要素：
针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的就在于提供一种采用超高效液相色 谱法同时检测12种抗氧剂和游离硫的方法，该检测方法有效地提高了分析效率，减少了溶 剂用量，降低了分析成本，且对环境友好。 采用超高效液相色谱法同时检测12种抗氧剂和游离硫的方法，具体包括以下步 骤： （1）配制标准溶液：分别称取游离硫及12种抗氧剂的标准品，所述12种抗氧剂分别为抗 氧剂BHT-COOH、抗氧剂1310、抗氧剂PTOP、2,4-DTBP、抗氧剂BHT-Q、抗氧剂TNPP、抗氧剂BHT、 3 CN 111595995 A 说 明 书 2/6 页 抗氧剂3114、抗氧剂1010、抗氧剂330、抗氧剂1076、抗氧剂168，并用有机溶剂配制成同时含 有各标准品的标准溶液，备用； （2）配制样品溶液：往待测样品中加入乙腈，涡旋摇匀后加入无机盐，然后经涡旋振荡 萃取、静置后得到上层清液，上层清液经有机滤膜过滤后即得样品溶液，备用； （3）检测：采用超高效液相色谱法分别对标准溶液和样品溶液进行梯度洗脱，得到标准 溶液和样品溶液的色谱图，然后将样品溶液色谱图中各色谱峰与标准溶液色谱峰的保留时 间进行对比，对样品溶液中的游离硫和12种抗氧剂进行定性分析，并通过各色谱峰的峰面 积计算出待测样品中游离硫和12种抗氧剂的含量； 超高效液相色谱的检测条件为：色谱柱为Shim-pack GIST-HP C18，规格为150 mm× 2.1 mm×3 μm；流动相A为甲醇，流动相B为0.1%磷酸水溶液；柱温为35~45℃，进样体积为5~ 7 μL，检测波长为230 nm。 进一步地，步骤（3）中的梯度洗脱程序为：0~0.1 min，流动相B的体积分数由60%降 至35%，流速为0.4 mL/min；0.1~10 min，流动相B的体积分数为由35%降至25%，流速为0.4 mL/min；10~20 min，流动相B的体积分数由25%降至0%，流速为0.4 mL/min；20~26 min，流动 相B的体积分数为0%，流速为0.8 mL/min。 进一步地，所述有机溶剂为乙腈、甲醇或乙醇中的一种或多种。 进一步地，标准溶液中各标准品的浓度范围为1.0~20.0 mg/L。 进一步地，若所述待测样品呈固态，在加乙腈之前先对待测样品进行溶解。 进一步地，所述有机滤膜为孔径为0.22 μm有机滤膜。 进一步地，步骤（2）中的无机盐为氯化钠、氯化钙、硫酸镁或硫酸锌中的一种或多 种。 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： 1、本发明利用超高效液相色谱同时检测12种抗氧剂和游离硫，能在26min内实现游离 硫和12种抗氧剂的有效分离和同时检测，具有灵敏度高、分析效果好，检测效率高等优点， 对12种抗氧剂和游离硫的平均加标回收率为84.3%~108.7%，相对标准偏差为0.1%~3.1%（n= 6），检出限(LODs)为0.1~0.4 mg/L；该检测方法可满足各类药品中12种抗氧剂和游离硫的 日常检测需求，具有良好的应用前景。 2、本发明通过对流动相种类、柱温进行精准调节和优化，尤其对梯度洗脱中各流 动相的体积占比以及流动相流速进行梯度变化，实现了对12种抗氧剂和游离硫进行同时分 离检测，分辨率高，选择性好，灵敏度高，分离效果好。 3、本发明开始采用0.1%磷酸水溶液和甲醇共同作为流动相，后采用甲醇单独作为 流动相，0.1%磷酸水溶液能有效保证保留时间较短的抗氧剂BHT-COOH和抗氧剂1310不被电 离，使得在固定相上的保留增强，从而改善其在色谱图中的峰形，进而保证了检测的准确 性。 附图说明 图1-实施例1同时对标准溶液中12种抗氧剂和游离硫检测得到的标准色谱图。 图2-实施例1同时对样品溶液中12种抗氧剂和游离硫检测得到的色谱图。 4 CN 111595995 A 说 明 书 3/6 页
本发明公开了采用超高效液相色谱法同时检测12种抗氧剂和游离硫的方法，采用超高效液相色谱法分别对标准溶液和样品溶液进行梯度洗脱，得到标准溶液和样品溶液的色谱图，然后将样品溶液色谱图中各色谱峰与标准溶液色谱峰的保留时间进行对比，对样品溶液中的游离硫和12种 全部
背景技术：
胶塞是药品包装材料中重要的密封组件。为获得高弹性、高耐磨、抗腐蚀等优良性 能，需在其合成加工的过程中进行硫化，常用的硫化剂主要包括硫磺和含硫化合物等，使用 硫磺作为硫化剂时，不可避免会存在硫的残留。另一方面，为抑制或延缓胶塞的氧化过程， 通常会加入抗氧剂，常用的抗氧剂主要分为受阻酚类和亚磷酸酯类，主要包括抗氧剂BHT- COOH、抗氧剂1310、抗氧剂PTOP、2,4-DTBP、抗氧剂BHT-Q、抗氧剂TNPP、抗氧剂BHT、抗氧剂 3114、抗氧剂1010、抗氧剂330、抗氧剂1076、抗氧剂168等12种抗氧剂。研究表明，受阻酚类 抗氧剂（如抗氧剂BHT、抗氧剂1010、抗氧剂330、抗氧剂1076和对特辛基苯酚（PTOP）等）能在 人体类蓄积，是一类环境雌激素，会对人体的生殖系统等产生危害；常用的亚磷酸酯类有抗 氧剂168、TNPP等，抗氧剂168容易降解产生毒性更大的2,4-二叔丁基苯酚（2,4-DTBP）。在药 品的实际贮存和使用过程中，药品与胶塞直接接触，胶塞中的硫化剂和抗氧剂等均存在浸 出的风险，从而影响药物的安全性。所以十分有必要对药品中是否含有以上12中抗氧剂和 游离硫进行分析检测。 目前，主要是采用液相色谱法检测药品中的抗氧剂和游离硫，但传统的液相色谱 法采用5 μm粒径的色谱柱，存在柱效不高、分析时间较长、有机溶剂消耗量大的缺点。同时， 根据现有文献报道，采用液相色谱法同时测定多种抗氧剂和游离硫均需要40min以上分析 时间，分析效率低，并且每个样品消耗的流动相体积大于40mL，分析成本高。 超高效液相色谱（UPLC）借助高效液相色谱（HPLC）的理论和原理，涵盖了小颗粒填 料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容 量。具有分析时间段、溶剂用量少等优点，但是目前对于怎样利用超高效液相色谱同时检测 12种抗氧剂和游离硫鲜有报道。 因此，怎样利用超高液相色谱同时检测12种抗氧剂和游离硫，以提高分析效率，减 少溶剂用量，降低分析成本是本领域技术人员渴望解决的技术问题。
技术实现要素：
针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的就在于提供一种采用超高效液相色 谱法同时检测12种抗氧剂和游离硫的方法，该检测方法有效地提高了分析效率，减少了溶 剂用量，降低了分析成本，且对环境友好。 采用超高效液相色谱法同时检测12种抗氧剂和游离硫的方法，具体包括以下步 骤： （1）配制标准溶液：分别称取游离硫及12种抗氧剂的标准品，所述12种抗氧剂分别为抗 氧剂BHT-COOH、抗氧剂1310、抗氧剂PTOP、2,4-DTBP、抗氧剂BHT-Q、抗氧剂TNPP、抗氧剂BHT、 3 CN 111595995 A 说 明 书 2/6 页 抗氧剂3114、抗氧剂1010、抗氧剂330、抗氧剂1076、抗氧剂168，并用有机溶剂配制成同时含 有各标准品的标准溶液，备用； （2）配制样品溶液：往待测样品中加入乙腈，涡旋摇匀后加入无机盐，然后经涡旋振荡 萃取、静置后得到上层清液，上层清液经有机滤膜过滤后即得样品溶液，备用； （3）检测：采用超高效液相色谱法分别对标准溶液和样品溶液进行梯度洗脱，得到标准 溶液和样品溶液的色谱图，然后将样品溶液色谱图中各色谱峰与标准溶液色谱峰的保留时 间进行对比，对样品溶液中的游离硫和12种抗氧剂进行定性分析，并通过各色谱峰的峰面 积计算出待测样品中游离硫和12种抗氧剂的含量； 超高效液相色谱的检测条件为：色谱柱为Shim-pack GIST-HP C18，规格为150 mm× 2.1 mm×3 μm；流动相A为甲醇，流动相B为0.1%磷酸水溶液；柱温为35~45℃，进样体积为5~ 7 μL，检测波长为230 nm。 进一步地，步骤（3）中的梯度洗脱程序为：0~0.1 min，流动相B的体积分数由60%降 至35%，流速为0.4 mL/min；0.1~10 min，流动相B的体积分数为由35%降至25%，流速为0.4 mL/min；10~20 min，流动相B的体积分数由25%降至0%，流速为0.4 mL/min；20~26 min，流动 相B的体积分数为0%，流速为0.8 mL/min。 进一步地，所述有机溶剂为乙腈、甲醇或乙醇中的一种或多种。 进一步地，标准溶液中各标准品的浓度范围为1.0~20.0 mg/L。 进一步地，若所述待测样品呈固态，在加乙腈之前先对待测样品进行溶解。 进一步地，所述有机滤膜为孔径为0.22 μm有机滤膜。 进一步地，步骤（2）中的无机盐为氯化钠、氯化钙、硫酸镁或硫酸锌中的一种或多 种。 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： 1、本发明利用超高效液相色谱同时检测12种抗氧剂和游离硫，能在26min内实现游离 硫和12种抗氧剂的有效分离和同时检测，具有灵敏度高、分析效果好，检测效率高等优点， 对12种抗氧剂和游离硫的平均加标回收率为84.3%~108.7%，相对标准偏差为0.1%~3.1%（n= 6），检出限(LODs)为0.1~0.4 mg/L；该检测方法可满足各类药品中12种抗氧剂和游离硫的 日常检测需求，具有良好的应用前景。 2、本发明通过对流动相种类、柱温进行精准调节和优化，尤其对梯度洗脱中各流 动相的体积占比以及流动相流速进行梯度变化，实现了对12种抗氧剂和游离硫进行同时分 离检测，分辨率高，选择性好，灵敏度高，分离效果好。 3、本发明开始采用0.1%磷酸水溶液和甲醇共同作为流动相，后采用甲醇单独作为 流动相，0.1%磷酸水溶液能有效保证保留时间较短的抗氧剂BHT-COOH和抗氧剂1310不被电 离，使得在固定相上的保留增强，从而改善其在色谱图中的峰形，进而保证了检测的准确 性。 附图说明 图1-实施例1同时对标准溶液中12种抗氧剂和游离硫检测得到的标准色谱图。 图2-实施例1同时对样品溶液中12种抗氧剂和游离硫检测得到的色谱图。 4 CN 111595995 A 说 明 书 3/6 页
