技术摘要：
本发明涉及细胞工程应用领域，具体涉及一种高频菜心离体组织培养方法。本发明将菜心种子经表面消毒后置于播种培养基上进行培养，得到苗龄为3～5d的无菌苗，然后在生长点上方平稳切下带柄子叶作为外植体，垂直插入分化培养基中进行分化培养，获得不定芽；将不定芽转至生  全部
背景技术：
菜心(Brassica  campestris  L.ssp.chinensis  var.utilis  Tsen  et  Lee)为十 字花科芸薹属白菜亚种的一个变种，是华南地区栽培面积和产量最大的蔬菜。菜心以菜薹 为主要食用器官，品质柔嫩，风味独特，营养丰富，受到广大消费者的喜爱；其适应性广，生 长周期短，可供周年生产，在蔬菜供应中占有重要地位。 培育菜心抗病虫和具有其他优良性状的新品种迫切需要建立稳定高效的再生体 系，以获得优良的种质资源。这就需要选择合适的外植体和适合外植体生长的培养基。此 外，在培育过程中会受到自身及外界因素的影响：基因型不同的植物细胞其分化能力不一； 相同基因型植物组织取材部位不一、苗龄不同，细胞分化能力也不相同；相同部位的植物组 织细胞在不同配方的分化培养基中，分化能力不一。 携带AA基因型的白菜类作物属于芸薹属再生率比较低的品种，其不定芽再生困 难，农杆菌不易感染且侵染后细胞不易分化，影响了基因工程在白菜品种改良上的应用。随 着白菜全基因组测序计划的完成，白菜开始成为十字花科植物功能基因组研究的模式植 物。关于芸薹属植物基因和功能的研究越来越多，因此急需一个稳定且高效的菜心离体组 织培养方法。
技术实现要素：
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的目的在于提供一种高频菜心离体组织 培养方法。 本发明的目的通过下述技术方案实现： 一种高频菜心离体组织培养方法，包含如下步骤： (1)将菜心种子经表面消毒后置于播种培养基上进行培养； (2)选取步骤(1)培养苗龄为3～5d的无菌苗，在生长点上方平稳切下带柄子叶作 为外植体，垂直插入分化培养基中进行分化培养，获得不定芽； (3)将步骤(2)获得的不定芽转至生根培养基中进行生根培养，获得组培苗； (4)将步骤(3)获得的组培苗开瓶炼苗，后续常规管理； 步骤(1)中所述的菜心的品种为“油绿501”、增城一号、60天甜菜心或碧清甜菜心； 步骤(1)中所述的表面消毒的具体操作优选为： 选取籽粒饱满的菜心种子放入离心管中，依次用无菌水冲洗2遍、体积分数为75％ 的乙醇溶液浸泡2min、无菌水冲洗2遍、质量分数为7.5％的NaClO(活性氯含量为4％)浸泡 10min，最后用无菌水冲洗三次并吸干水分； 步骤(2)中所述的无菌苗的最佳苗龄为3d； 步骤(2)中所述的分化培养基包含如下按终浓度计的组分： 3 CN 111727885 A 说　明　书 2/8 页 MS 0.3mg/L  NAA 5mg/L  6-BA 30g/L蔗糖 12g/L琼脂 2mg/L  AgNO3，pH＝5.8； 步骤(2)中所述的带柄子叶的子叶柄的长度优选为0.5cm； 步骤(2)中所述的分化培养的时间优选为40d； 步骤(3)中所述的不定芽的长度优选为1.0～2.0cm； 步骤(3)中所述的生根培养基包含如下按终浓度计的组分： MS 0.3mg/L  NAA 30g/L蔗糖 12g/L琼脂 5mg/L  AgNO3，pH＝5.8； 步骤(3)中所述的生根培养优选培养至长出健壮的主根； 步骤(4)中所述的炼苗的方式为：选择不定根生长健壮的组培苗，洗去根上所有培 养基，转移至含有泥炭和蛭石的混合基质中，保鲜袋套袋5～10天，后续常规管理； 所述的泥炭和蛭石的质量比优选为1:1； 所述的保鲜袋优选具有若干孔洞，以利于植物呼吸； 步骤(1)、(2)(3)、(4)中组织培养的环境条件为25℃、16h光照/8h黑暗、光照使用 110μmol/m2s1的白色LED灯； 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果： (1)本发明以菜心为材料，研究不同苗龄、外植体类型、6-BA与NAA配比、渗透压、琼 脂浓度、AgNO3浓度对不定芽再生率的影响，建立菜心高频再生体系，为菜心遗传转化体系 的建立奠定基础。 (2)本发明建立的菜心高频再生体系不定芽再生率高，愈伤组织容易形成，污染率 低，操作简便，综合性能高，为菜心遗传转化体系的建立奠定基础。 附图说明 图1是菜心种子播种后获得菜心无菌幼苗的结果图；其中，A：播种；B：3d苗龄的菜 心无菌幼苗。 图2是实施例2中不同外植体类型对不定芽分化的影响结果图；其中，A：带柄子叶， B：子叶，C：茎段，1：正面拍摄，2：底部拍摄。 图3是实施例4中分化、生根和炼苗结果图，其中，A：最佳分化培养基中长势良好的 不定芽，该不定芽可用于下一步的生根培养，B：最佳生根培养基中不定根萌发情况，C：炼苗 套袋情况。